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定量PCR实验技术分享1

时间:2017-08-02 浏览次数:2067

1.  如果扩增曲线ct值比较靠后的话,32左右,一般有什么方法解决没有

 

ct值比较靠后,对实验有一定的影响,因为经过那么多次的循环,酶的活性有可能有所下降,这时候扩增效率会有所改变(而定量PCR的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值)。因此能够把ct值往前移。
 

解决办法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。

 

 

2. 为什么合成的引物做不加摸板的对照也能扩增出目的条带,而内参用同样体系就没有呢?

 

引物被污染。

 

3. 实时定量PCR,荧光定量PCR,实时荧光定量PCR,real-time PCR,这些是不是同一个概念

 

是一个概念。

 

4. 我的标准曲线的slope总是大于4,而且每个梯度的平行ct值差别比较大,原因?

 

这个斜率是=1/LOG 10(扩增效率),理论上扩增效率=2,斜率是3.322。如果斜率大于4,说明扩增效率比较小。可以考查一下反应体系是否合理?酶活是否正常?
 

平行管的CT值差别大可以考查一下自己实验操作是否规范,另外一种原因就是仪器本身的误差也可能会导致CT值差别比较大。

 

当斜率为4的时候,扩增效率是77.8%,斜率大于4的话,效率继续下降。
 

扩增效率的问题实际就是引物的扩增效率,可能酶活的关系没有那么重要,前提是试剂盒的质量有保证。回到扩增效率,只有在引物和模板处于zui适比例时才能得到比较满意的扩增效率,因此通过调节PCR反应体系中的引物终浓度来解决,可以做一些引物梯度来比较。

 

5. ROX染料是什么作用?

 

ROX的作用ABI宣称是用来校准加样误差的。
 

但是据说ROX的作用实际上是用来校准光程差的。即每个孔的荧光信号经过滤光片在经过聚焦到CCD的时候,走过的光程是不一样的,这样在CCD上成像的亮度就不一样了。所以需要把这个差异用ROX来计算孔间差异有多大,然后差异系数去处理,实际的荧光信号。具体过程我不是非常清楚,请高手指正。

 

 

6. 荧光定量PCR的基线,是怎么确定的呢?

 

基线就是背景值,因此就是曲线在没有“起跳”之前的一段。在软件上有一个地方可以输入baseline从第几到第几cycle作为基线。设置原则是使没有起跳之前zui多的cycle的信号接近0。

 

 

7. 我刚准备做定量,请教一下,不知道伯乐的机子怎么样?请推荐几个合适的SYBR GREEN的盒子,1000以内的(没钱不好办啊),我大约做20个样。现在对SYBR GREEN认可吗?


伯乐的机子不错。takara的试剂盒,大概在1500元,400个反应。大部分人做还是用sybr green I的。这是zui常用的染料。

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