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体外细胞的原代培养、冻存和复苏,传代培养

时间:2017-08-02 浏览次数:2244

三、实验结果计算

1.一只小鼠可获得(1~2.5)×108个脾细胞。

2.细胞接种后一般几小时内就能贴壁,并开始生长,如接种的细胞密度适宜,5天到一周即可形成单层。

3.一般情况,传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上,2~4天就可在瓶内形成单层,需要再次进行传代。

四、注意事项

1.取材要求新鲜,无菌,解剖小鼠时,注意不要损伤脾脏及其周围的脏器,尤其是肠道等,防止污染脾脏。

2.冲洗脾脏时要尽量洗净血污,去除无用组织,并要防止组织干燥。

3.碾磨后及时用清水冲洗筛网,防止组织、细胞阻塞网孔。

4.计数前,注意吸尽平皿里的细胞,充分混匀,使细胞分散成单个细胞。

5.实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘非无菌区域操作。

6.金属器械不能在火焰中烧的时间过长,烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织,以免造成组织损伤。

7.另外胶塞过火焰时也不能时间长,以免烧焦产生有毒气体,危害培养细胞。

8.吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼,因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜,再用时会把有害物带入营养液中。

9.不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部,吸管前部等所有可能与细胞接触的部分,如已接触,要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

10.开启、关闭长有细胞的培养瓶时,火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。

11.换液时倾倒废液,瓶口不能接触废液缸,速度不能过快,防止废液四溅。

12.吹打细胞时,要注意边角的细胞是否吹打下来。

13.手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上,即不可以在开放容器上方操作。

14.每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染。

15.注意自身的安全,对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中,应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂例如DMSO,并避免尖锐物品伤人等。

16.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但为对数生长期细胞。在冻存前一天换一次培养液。

17.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤。

18.冻存和复苏用新配制的培养液。

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