低温保存管（cryo tube）中之一般菌种临时存放及活化

A. 低温保存管之临时存放及解冻

1. 低温保存管（cryo tube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。

2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。

3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。

4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰*溶解（约需 2 分钟）。

C. 菌株活化: 在无菌操作下

1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态培养基（培养基编号及温度示于菌株订购单）某一边缘附近，以划线法接种于培养基。

2. 将接种好的培养基置于温度的培养箱中培养。

D. 图示

（1）金属接种环

（2）平板划线法

冷冻干燥管之开管说明

下列步骤请在无菌环境下操作：

1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之。

2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破。

3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。

4、（ a ） 适用于细菌
用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。
（ b ） 适用于霉菌、酵母菌
用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。

5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入的液体培养基内，并依的温度培养之。

6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期 （ lag period ） 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养 （Subculture） 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。

7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。

8．未开封之冷冻干燥管，请冷藏于4℃冰箱，切勿冷冻保存。

B. 划线法

1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环*冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。

2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。

3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。

4. 灼烧接种环，将接种环归位。