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农杆菌感受态细胞制备实验
更新时间：2013-03-02 浏览次数：1727
| 实验方法原理 | 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。 |
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、实验仪器、材料和试剂 1. 仪器
超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml离心管，冰浴，微量进样器及吸头。 以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 2. 材料
土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 3. 试剂
（1）YEB液体培养基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH7.0，高压灭菌。 （2）利福平（Rif）储液：50 mg/ml （3）20 mM CaCl2，高压灭菌。 二、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3 ml的YEB液体培养基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振荡培养过夜。 2. 取过夜培养菌液1 ml接种于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5。 3. 取2 ml菌液，13 000 rpm，离心30 sec，弃上清。 4、加入1000 μl 20 mM CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30 min。 5、13 000 rpm，离心30 sec，弃上清，置于冰上，加入500 μl预冷的20 mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24 hr内使用，或液氮中速冻1 min，置-70℃保存备用。 收起 |
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、试剂配制
1 mM HEPES的配制：称取0.119 g HEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500 ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。
二、实验步骤
1. 挑取单克隆接种于2 ml YEP（含50 mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250 rpm，振荡培养过夜。（如用5 mlYEP，需培养36 h） 2. 将菌液按1:100转移至200 ml YEP（含50 mg/l链霉素）培养液中，28℃，250 rpm，振荡培养至OD=0.3（约4~5 h）。 3. 转入50 ml的无菌离心管，4℃，4 000 rpm离心10 min，弃上清。 4. 用20 ml冰浴的HEPES（1 mM，PH7.0）重悬。 5. 4℃，4 000 rpm离心10 min，弃上清。 6. 重复4、5步骤2~3次。 7. 用2 ml冰浴的10%甘油重悬。 8. 每管100 μl分装于1.5 ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。 展开 |
| 注意事项 | 1. HEPES需现用现配。 展开 |
snokey: 农杆菌转化注意事项
农杆菌转化注意事项： 1. 感受态尽量新，而且不要太浓（0.3-0.5）； 2. CaCl2尽量新； 3. 涂板只加Kan 50mg/L，等出了菌落再加到100mg/L； 4. pBI121本身拷贝数低，转化子可能长的就慢些； 5. LB营养没有YEP丰富，其实关系不大； 6. 4404不好用，能用105就不要用4404，105转化效率通常比4404好的多 。
发表于2006-08-01 23:17
seesky: 农杆菌质粒提取和酶切问题
从农杆菌中可以抽出质粒，但做不了酶切试验，原因是： 1. 量太少，主要是菌裂解困难，以及农杆菌双元载体携带的是低拷贝复制子； 2. 杂质太多，酶切后呈现smear带，无法判断是否有目标基因。