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流式检测细胞样品的制备

更新时间：2013-04-24 浏览次数：1703

方案A：组织培养细胞的制备。
方案B：淋巴组织细胞制备。
方案C：非淋巴组织细胞制备。
方案D：全血PBMC的分离。

小贴士
1、流式细胞仪检测需要将细胞制备成单细胞悬液。
2、避免细胞成团，以免堵塞流式细胞仪。
3、实体组织制备单细胞悬液需要物理方法分离或酶消化法进行，具体组织的方法，依照经验来进行。


方案A: 组织培养细胞的制备

实验材料：
Accutase™ 酶细胞分离培养基 （eBioscience Cat. No. 00-4555）
eBioscience® 流式染色缓冲液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的离心管。

实验流程：
1、如果是悬浮细胞，则小心将细胞移入离心管中，进行计数和活力分析。进行步骤3.
2、如果是贴壁细胞，建议使用Accutase™ 酶细胞分离培养基 （eBioscience Cat. No. 00-4555）是细胞团块分离，制备成单细胞悬液后置于离心管中计数和活力分析。（注意:accutase 可能会改变某些细胞表位，应该预实验观察避免其干扰检测）
3、300g 离心5min。弃去上清，应用适量的流式染色缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为2×107/ml。


方案B：淋巴组织细胞制备。

实验材料：
60×15mm 的组织培养皿
5ml 注射器
细胞过滤器（尼龙网过滤）
eBioscience® 流式染色缓冲液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的离心管。

实验方案：
1、获取组织（脾脏，淋巴结或胸腺）加入5~10ml eBioscience® 流式染色缓冲液 （eBioscience Cat. No. 00-4222），使用5ml注射器注射心研磨组织（或采用两片载玻片研磨亦可）。
2、收集磨碎的细胞悬液，过滤至离心管中计数和活力分析。
3、300g 离心5min。弃去上清，应用适量的流式染色缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为2×107/ml。


方案C：非淋巴组织细胞制备。

剪刀和手术刀片
剪刀和手术刀片
PBS
60×15mm 的组织培养皿
5ml 注射器
细胞过滤器（尼龙网过滤）
eBioscience® 流式染色缓冲液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的离心管。

实验流程:
1、获取组织剪碎或切碎组织为2~4mm碎块，用PBS稀释适量的酶进行消化（温度，方法依照酶的说明书）。
2、小心分离细胞团块，过滤除去死细胞和碎片。
3、300g 离心5min，弃去上清。加PBS 5ml 300g 离心5min，弃去上清，重复一次。计数和活力分析。
4、300g 离心5min，弃去上清，应用适量的流式染色缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为2×107/ml。


方案D：全血PBMC的分离。

实验材料：
PBS
Ficoll® 淋巴细胞分离液
eBioscience® 流式染色缓冲液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的离心管。

实验流程：
1、以PBS 1:1稀释血样。将血样轻轻加到2ml Ficoll® 淋巴细胞分离液或其他品牌亦可。
2、1000g离心20min,小心吸取分离液和PBS之间的雾状细胞，即为PBMC。至新的离心管中。
3、4度，300g 离心5min,弃上清。应用适量的流式染色缓冲液重悬细胞，计数和细胞活力，调整细胞浓度为2×107/ml。

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