1.  培养5 ml 的细菌培养物至饱和状态，取1.5 ml 的培养物离心2 min。

2.  沉淀物加入567 μl 的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。

3.  加入30 μl10%的SDS和3 ℃ 20mg/ml蛋白酶K，混匀，于37℃温育1 h。

 

4.  加入100 μl 5 mol/l NaCl充分混匀，再加入80 μlCTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育10 min。

 

5.  加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，离心4~5 min将上清液转人一个新管中，如果难以移出上清，先用牙签除去界面物质。

 

6.  加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心5 min，将上清液转入一只新管中。

 

7.  加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，用一个封口的巴斯德管将沉淀转移至1 ml 的70%乙醇中洗涤。

 

8.  离心5 min，弃上清，用冻干机稍加干燥，重溶于的下100 μl TE缓冲液，每次酶切反应用10~15 μl。

1.  培养100 ml 细菌培养物至饱和状态，用JA-20转子4 000 g 离心10 min。

2.  用9.5 ml 的TE缓冲液重悬沉淀。

3.  加0.5 ml 10%的SDS和50 μl 20 mg/ml 的蛋白酶K，混合，于37℃温育1 h。

4.  加1.8 ml 5 mol/l NaCl，充分混合，加入1. 5 ml CTAB/NaCl溶液，混合，于65℃温育20 min。

 

5.  加等体积的氯仿/异戊醇抽提，室温下6 000 g 离心10 min，用宽口吸管将上清液转移至新管中。

 

6.  加化6体积的异丙醇，轻轻混合直至沉淀下来，用一个封口的巴斯德吸管将沉淀转移至70%乙醇中冼涤。

 

7.  10 000 g 离心5 min，弃上清，用4 ml TE缓冲液重悬沉淀。

8.  用分光光度计检测DNA的浓度，将其调节到50~100 μg/ml。

9.  每4 ml 缓冲液加人4.3 g CsCl，并使之溶解，加入200 μl 的10 mg/ml 的溴化乙锭。

10.  转移至4 ml 快封口离心管中，调节体积，用TE缓祌液配制的CsCl平衡离心管，封住管口。

11.  用VTi80转子于15℃，以420 000 g 离心4 h或 250 000 g。

 

12.  在长波紫外灯下观察梯带，用15号针头和3 ml 塑料注射器移出条带。

13.  用CsCl饱和的异丙醇或水饱和的丁醇离心抽提，以除去溴化乙锭。

14.  在2 L TE缓冲液中透折以除去CsCl，如果必要，沉淀DNA并重新溶解至所需要的浓度。