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感受态制备：农杆菌感受态细胞制备实验
更新时间：2013-10-30 浏览次数：1105
农杆菌感受态细胞制备实验
农杆菌感受态细胞制备可以：（1）用于建立农杆菌转化体系；（2）用于农杆菌表达系统构建；（3）用于农杆菌其他分子生物学研究。
实验方法
- 氯化钙法
- 电转农杆菌感受态
| 实验方法原理 | 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。 |
|---|---|
| 实验材料 | 土壤农杆菌LBA4404菌株 |
| 试剂、试剂盒 | YEB液体培养基 酵母提取物 牛肉膏 蛋白胨 蔗糖 硫酸镁 氯化钙 利福平储液 |
| 仪器、耗材 | 超净工作台 恒温摇床 冷冻高速离心机 高压灭菌锅 冰箱 超低温冰柜 分光光度计 接种针 试管 离心管 离心管 冰浴 微量进样器 吸头 |
| 实验步骤 | 一、实验仪器、材料和试剂 1. 仪器 超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml离心管，冰浴，微量进样器及吸头。 以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 2. 材料 土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 3. 试剂 （1）YEB液体培养基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH7.0，高压灭菌。 （2）利福平（Rif）储液：50 mg/ml （3）20 mM CaCl2，高压灭菌。 二、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3 ml的YEB液体培养基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振荡培养过。 2. 取过培养菌液1 ml接种于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5。 3. 取2 ml菌液，13 000 rpm，离心30 sec，弃上清。 4、加入1000 μl 20 mM CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30 min。 5、13 000 rpm，离心30 sec，弃上清，置于冰上，加入500 μl预冷的20 mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24 hr内使用，或液氮中速冻1 min，置-70℃保存备用。 |
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