PCR技术专题：差示反转录PCR实验
更新时间：2013-11-25 浏览次数：1056
标签： 差示 反转录 PCR
差示反转录PCR也称为mRNA差异显示技术，它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不同处理或处于不同发育阶段的样品，该方法自问世以来已被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。
实验方法
- mRNA差异显示法
- 荧光标记法
| 实验方法原理 | 几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly（A）尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo（dT）为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly（A）序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P.Peng等人设计合成三中不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo（dT）引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA段。 |
|---|---|
| 实验材料 | 红豆杉细胞 |
| 试剂、试剂盒 | 丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺 SuperscriptTMⅡ试剂 柠檬酸钠 Taq DNA聚合酶 dNTPs 十二烷基肌氨酸钠 巯基乙醇 RNAimage试剂盒 异硫氰酸胍 焦碳酸二乙酯 |
| 仪器、耗材 | 基因扩增仪 凝胶成像系统 超低温冰箱 电热鼓风干燥箱 超净台 脱色摇床 核酸定量仪 多用电泳仪 DNA序列分析电泳槽 |
| 实验步骤 | 一、实验材料
1. 红豆杉细胞
未经MJ诱导处理的A和经MJ诱导处理的B红豆杉细胞。
2. 寡核苷酸引物
（1）3’锚定引物： ①H-T11A（2uM）： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’ ②H-T11C（2uM）： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’ ③H-T11G（2uM）： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’
（2）5’ 随机引物：
Kit引物： ①H-AP1（2uM）： 5’-AAGCTTGATTGCC-3’ ②H-AP2（2uM）： 5’-AAGCTTCGACTGT-3’ ③H-AP3（2uM）： 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’ ④H-AP4（2uM）： 5’-AAGCTTCTCAACG-3’ ⑤H-AP5（2uM）： 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’ ⑥H-AP6（2uM）： 5’-AAGCTTGCACCAT-3’ ⑦H-AP7（2uM）： 5’-AAGCTTAACGAGG-3’ ⑧H-AP8（2uM）： 5’-AAGCTTTTACCGC-3’
生工引物： ①H-AP1（2uM）： 5’-AAGCTTCATTCCG-3’ ②H-AP2（2uM）： 5’-AAGCTTCCACGTA-3’ ③H-AP3（2uM）： 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’ ④H-AP4（2uM）： 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’ ⑤H-AP5（2uM）： 5’-AAGCTTCGGCATA-3’ ⑥H-AP6（2uM）： 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’ ⑦H-AP7（2uM）： 5’-AAGCTTACGCAAC-3’ ⑧H-AP8（2uM）： 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’
特异引物： ①5ac： 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’ ②ck5： 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’ ③10ac： 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’ ④10acb： 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’ ⑤2ben： 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’ ⑥3ben：5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’ ⑦Phen：5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’
二、 实验方法
2. 总RNA的提取与检测
（1）用品的准备
塑料器皿，如离心管、Tip头等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌并烘干后使用；所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上，高压灭菌后4℃保存；玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上，冷却备用。
（2）试剂的配置
① CSB缓冲液
42 mmol/L 柠檬酸钠（Sodum citrate）
0.83%（W/V）十二烷基肌氨酸钠（N-lauryl sarcosine）
0.2 mmol/L 巯基乙醇（β-mercaptoethanol）（使用前加入）
（3）RNA提取
对悬浮培养细胞A、B进行RNA提取，提取步骤如下：
① 50 ml 离心管中加入10 ml 变性匀浆液，冰浴5分钟。
② 取0.5 g 细胞在液氮中研磨至粉末，转移至预冷的变性匀浆液中，加200 ul β-巯基乙醇，振荡混匀。
③迅速加入1 ml 2 mol/L 乙酸钠（pH4.0），充分混合。
④ 加入10 ml 水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。
⑤ 加入2 ml 氯仿：异戊醇（24：1），剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟。
⑥ 4℃，12 000 g，离心20分钟。
⑦ 小心移取上层水相，弃去中间相和下层有机相。
⑧ 加入6 ml 水饱和酚，剧烈振荡10~15秒，在冰上放置5分钟。
⑨ 加入6 ml 氯仿：异戊醇（24：1），剧烈振荡10~15秒，在冰上放置15分钟 |