1.  放射性标记的磷酸化蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行制备电泳。电转移至PVDF膜上，用水洗膜数次，不要让膜变干。

2.  用30~50 ml 印度墨汁染色液染膜5~10 min，轻摇至条带出现。也可在作好放射性或磷光位置标记后，用塑料膜包住膜，进行放射性自显影。

3.  用干净刀片切下含目的条带的膜，用甲醇将膜重新润湿1 min，再用多于0.5 ml 水的润湿。置于带螺口盖的微量离心管。

4.  加入足够量的6 mol/l HCl，淹没膜，拧紧管盖，在110℃烤箱温育60 min。

5.  自然冷却，高速离心2 min，将液相的水解物移至一个新的微离心管中，真空干燥2 h。

 

6.  加入6~10 μl 水，在旋涡混合器上剧烈振荡以溶解样品，高速离心5 min。

7.  取25%~50%的样品点样于20 cm×20 cm×100 μm 纤维素薄层色谱板的样品孔。分小份点样，毎次点加0.25~0.5 μl，在每次点加之间，用通过塞有棉花的巴斯德吸管所送出的压缩空气吹干加样点。

8.  取1 μl 非放射性的磷酸氨基酸标准混合物（含磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸）点在每个样品之上，如上分次点加，每次0.25~0.5 μl。

9.  在大的玻璃托盘或塑料盒内，用pH1.9电泳缓冲液浸湿大的吸水纸（带4个孔），缓缓倒干多余的缓冲液。将此大吸水纸转移覆盖在已加样的薄层色谱板上，使得色谱板上的4个加样点位干大吸水纸的四个洞的中央，轻压吸水纸以润湿纤锥素和样品，当色谱板均匀润湿后，移去吸水纸。

10.  将薄层色谱板置于电泳装置内，在板的左右两俩0.5 cm 边缘用Whatman 3MM 纸搭接，如果有气泡，将其弄平排出。盖上盖子，开始电泳。在HTLE 7 000电泳仪用双层厚的Whatman 3MM 纸搭接时，载4个样品的薄层板在1.5 KV 电泳20 min。
 

图1 磷酸氨基酸在pH1.9进行*向电泳分离
 

11.  电泳后，取出薄层板，用电吹风快速吹干20 min（无须加热）。

12.  用pH3.5电泳缓冲液湲湿小的吸水纸，并如步骤10所述以之去均匀润湿薄层色谱板，注意避免将吸水纸放在样品之上。