细胞技术专题：细胞原代培养实验
更新时间：2014-02-13 浏览次数：1316
标签： 细胞 原代培养
细胞原代培养可以：（1）为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段；（2）为传代培养创造条件；（3）服务于临床实践，用于药物筛选等。
实验方法
- 胰酶消化法
- 组织块直接培养法
| 实验方法原理 | 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把*代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。zui常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。
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|---|---|
| 实验材料 | 胎鼠 新生鼠 |
| 试剂、试剂盒 | 1640培养基 牛血清 胰酶 Hank’s液 碘酒 |
| 仪器、耗材 | 培养箱 培养瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿 吸管 移液管 纱布 手术器械 血球计数板 离心机 水浴箱 |
| 实验步骤 | 一、实验材料准备 1. Hank’s液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。 1. 将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2-3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2. 用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3. 用手术剪将肝脏剪成小块（1 mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5. 加入3-5 ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7. 1 000 rpm，离心10分钟，弃上清液。
8. 加入Hank’s液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9. 加入培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 收起 |
| 注意事项 | 1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。 2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 4. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 7. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 9. 吸溶液的吸管等不能混用 |