大鼠

MEM FBS 胰酶 EDTA D-Hanks’液

眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱

1. SD 大鼠经低温麻醉后以碘酒和75%乙醇消毒，无菌操作下，断头放入预冷的D-Hanks’液中，在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜。

2. 剪碎组织成1 mm³ 大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入 37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。

3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的 MEM＋10%FBS(Glial Medium，GM)的离心管内终止消化液作用5 min。

4. 吸出组织转移到另一支装有冷的 GM 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤 2～3 次。

5. 所得上清于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液并吹打成单细胞悬液。细胞计数，调整细胞密度1.5×10⁵/cm² 种入 25 cm² 培养瓶，放入孵箱培养。以后每隔2～3 d 进行全量换液。

6. 摇床振摇分离星形胶质细胞和少突胶质细胞：培养至7～10 天，换液后放入孵箱继续培养24 h，取出拧紧培养瓶盖，于37℃恒温摇床上280 rpm 摇 动18 h。此时寡突胶质细胞 90%以上在培养悬液内而与瓶底贴壁的星形胶质细胞分离。

7. 分离培养悬液内的少突胶质细胞：吸出悬液至离心管内950  rpm 离心10  min，弃上清后管内加入新鲜GM，吹打成单细胞悬液，按1.5×10⁵/cm² 种入预先用100 µg/L 多聚赖氨酸包被好的 35 mm 培养皿培养。24 h 后换成DF12＋N2 的无血清 培养液，此后每三天半量换液1 次。

8. 瓶底星形胶质细胞的继续培养：25 cm² 培养瓶内的星形胶质细胞用D-Hanks’液洗2 次后常规传代，以 1.5×10⁵/cm² 种入预先用100 µg/L 多聚赖氨酸包被好的35 mm 培养皿培养。培养液为GM，每三天半量换液1 次。附GFAP鉴定星形胶质细胞图片。

图1：星形胶质细胞(GFAP 鉴定)

大鼠

CMF-Hanks液 胰蛋白酶 DMEM F12

水浴锅 培养箱

一、原代培养

1.  选用生后1周的新生大白鼠，用碘酒,酒精棉球消毒，断头取其大脑皮层组织。
 

2.  解剖显微镜下，剥离脑膜，切除大脑髓质部分。
 

3.  将大脑皮质在无Ca²⁺、Mg²⁺Hanks液(CMF-Hanks液)中剪碎。
 

4.  室温下静置10 min。
 

5.  在37℃水浴箱中用0.125%的胰蛋白酶(用CMF-Hanks液配制)消化30 min。
 

6.  加入少许含20%血清的DMEM/F12(DMEM与F12为1:1)混合培养液(下同)，用吸管稍加吹打至胰酶液与培养液混匀。离心5 min(1 000 r/min)。
 

7.  吸去上清含酶液，重新加入含血清培养液，用吸管反复吹打至组织块消散为止。制成细胞悬液(暂称初细胞悬液)。
 

8.  将初细胞悬液接种到玻璃瓶(或培养皿)中，于37℃、5%CO₂培养箱中孵育30 min。
 

9.  翻转培养瓶,吸出瓶中的细胞悬液。用孔径为75μm的不锈钢网过滤。
 

10.  将滤过液离心10 min(1 000 r/min)，浓缩成约3ml的细胞悬液(暂称为次细胞悬液)。
 

11.  将次细胞悬液种植到预先涂布有多聚赖氨酸的培养瓶中。接种的细胞密度约1×10⁴个/cm²。
 

12.  置CO₂培养箱中培养3-5h,再补加足够的培养液,继续培养9-14 h。培养液颜色略微变黄时换液。

二、原代培养物的传代
 

1.  吸取旧培养液用CMF-Hanks液洗涤2次。
 

2.加入少许0.125%的胰蛋白液消化15 min。以有血清培养液终止胰酶活性。
 

3.稍事手动摇晃,倒掉含酶液。加入有血清培养液。
 

4.用吸管反复吹打使细胞从培养瓶壁脱落。收集细胞悬液,离心10 min(1 000 r/min)。弃上清液，给细胞沉淀物再加入培养液制成细胞悬液。
 

5.重复原代培养时8-10步。
 

6.将细胞悬液按0.5×10⁵个/cm²的密度种植在经鼠尾胶原包被的培养瓶中。
 

7.送入CO₂培养箱中培养3-5 h，再加足够的培养液,继续培养。

三、结果

分离的大鼠大脑皮质细胞在原代培养4 h后，部分细胞即可长出细小胞突。培养3-4 d之后，细胞数量便明显增大。大鼠大脑皮质细胞原代培养一般在9-14 d，以星形胶质细胞为主的细胞即可长满培养瓶壁。