一、实验前应明确的问题

1.  选择适当的细胞接种浓度。

一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2.  药物浓度的设定。

一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3.  时间点的设定。

在不同时间点的测定OD值，输入excel表，zui后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的zui明显）。

4.  培养时间。

200 ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68 h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48 h换液的。

5.  MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞数。

做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6.  理论未必都是对的。

要根据自己的实际情况调整。

7.  实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。

调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

8.  避免血清干扰。

用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

二、实验步骤

（一）贴壁细胞

1.  收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 ul，铺板使待测细胞调密度至1 000-10 000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2.  5%CO₂，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度，每孔100 ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况。

3.  5%CO₂，37 ℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4.  每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5.  终止培养，小心吸去孔内培养液。

6.  每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。

7.  同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

（二）悬浮细胞

1.  收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40 ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培养液稀释 （储存液100 ug/ml，需预试寻找*稀释度，1：10-1：20）；③需检测物10 ul；④细胞悬液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100 ul 1640）。

2.  置37 ℃，5%CO₂孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

3.  每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570 nm（630 nm校准）测量各孔的吸光值）

4.  离心（1000转x10 min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570 nm（630 nm校准）测量各孔的吸光值。

5.  同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。