小鼠

中性福尔马林固定液 酒精 二甲苯 石蜡 蜂蜡 苏木精染液 伊红酒精溶液 盐酸酒精溶液 甘油蛋白粘片剂 中性树胶 卡诺固定液

切片机 恒温箱 蜡杯 酒精灯 解剖剪 培养皿 镊子 单面刀片 包埋盒 染色缸 盖玻片 载玻片 玻片盘 显微镜 温度计 水浴锅

一、材料准备：

1.  中性甲醛固定液：

甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度）100 mL

磷酸氢二钠6.5 g

磷酸二氢钾（钠）4 g

双蒸水900 mL

2.  1%盐酸乙醇液：

盐酸1份

70%酒精100份

3.  甘油蛋白贴片剂：

蛋白50 ml

甘油50 ml

水杨酸钠（防腐剂）1 g

4.  配制

（1）将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫。

（2）然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。

（3）此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。

（4）zui后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。

二、实验步骤：

1.  取材

（1）颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。

（2）切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5 mm×5 mm×2 mm或10 mm×10 mm×2 mm 为宜。

（3）取下所需要的肝组织，切成一小块2~3 mm 厚。

2.  固定

（1）将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下

（2）立即投入中性福尔马林固定液中固定

（3）固定30~50 min。

3.  洗涤

材料经固定后，流水冲洗，数小时或过。

4.  脱水

（1）材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30 min。

（2）再放入95%、100%各2次，每次20 min。

5.  透明

（1）纯酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min（至透明为止）。

（2）由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。

（3）当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

6.  透蜡

（1）放入二甲苯和石蜡各半的混合液15 min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50~60分钟。

（2）透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。

（3）透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5 h。

7.  包埋

（1）包埋时，用镊子夹取石蜡模子（金属质地）在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上。

（2）从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。

（3）再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。

（4）再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。

8.  切片

（1）将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。

（2）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。

（3）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。

（4）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。

（5）调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4~10微米。

（6）一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40~50 r/min。

（7）切成的蜡带到20~30 cm 长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。

（8）用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。

（9）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。

9.  展片、贴片

打开水浴锅，使水温维持在40~45℃，另准备30%乙醇溶液。

（1）切片时，将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。

（2）用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在乙醇溶液的水面上，使切片展开。

（3）小镊子轻轻地将连在一起的切片分开，用一个载玻片将切片完整，已展开的切片捞至温水中，使之充分展开。

（4）另取洁净的载玻片，捞起展开的切片，使其位于切片1/3处，另一端（磨边，粗糙的一端）磨面上标记或贴上标签，放于切片架上。

10.  脱蜡复水

（1）将水浴锅温度调至60℃，待水温控制在60℃时。

（2）将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子（可密封），30 min 至蜡熔化。

（3）之后，石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5 min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各3~5 min，再放入蒸馏水中3 min。

11.  染色

（1）切片放入苏木精中染色约10~30 min。

（2）染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。

（3）室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

12.  水洗

（1）用自来水流水冲洗约15 min。

（2）使切片颜色变蓝（或放入碱性水中也可）。

（3）但要注意流水不能过大，以防切片脱落。

13.  分化

（1）将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色。

（2）约2秒至数十秒钟，见切片变红，颜色较浅即可。

14.  漂洗

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。

15.  脱水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5 min。

16.  复染

（1）用0.5%伊红乙醇液对比染色1~3 min。

（2）伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。

（3）反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。

17.  脱水Ⅱ

（1）将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色。

（2）然后放入无水乙醇中3~5 min。

（3）zui后用吸水纸吸干多余的乙醇。

18.  透明

（1）切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5 min。

（2）二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。

（3）切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。

19.  封藏：中性树胶封存

因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。

20.  封藏的方法：

（1）封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。

（2）材料透明后，在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上）。

（3）迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。

（4）如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。

（5）如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。

（6）染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

三、免疫组化染色

1.  石蜡切片，步骤同前。切片经贴片后，60℃烤片30 min使蜡熔化，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，脱蜡。然后，将切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3~5 min，再放入蒸馏水中3 min，水化。

2.  脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4，具体看所用抗体及染色试剂说明）冲洗3次，每次3分钟。洗瓶冲洗。

3.  根据抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。可选步骤，具体见抗体说明书。

4.  每张切片加1滴或50 μl 3%过氧化氢，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。此步骤是对内源性过氧化物酶含量高的组织而言。

5.  除去PBS液，每张切片加1滴或50 μl 的*抗体，室温下孵育60分钟或4℃过，具体参见每种抗体的说明书。PBS冲洗3次，每次3分钟。

6.  除去PBS液，每张切片加1滴或50 μl 即用型MaxVisionTM试剂或SP试剂，室温下孵育10~15分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。

7.  除去PBS液，每张切片加2滴或100 μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3~5分钟（DAB）或37℃环境下10~30分钟（AEC）。

8.  自来水冲洗，苏木素复染10分钟，PBS或自来水冲洗返蓝。如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，步骤同H-E染色，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。

一、取材注意事项

1.  取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

二、固定注意事项

1.  一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。

2.  有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。

3.  固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1~2次新液。

三、脱水注意事项

1.  脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。

2.  在更换高一级的脱水剂时，不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。

3.  在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。

4.  在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。

5.  如需过，应停留在70%酒精中。

四、透明注意事项

1.  使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。

2.  更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。

五、透蜡注意事项

1.  尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度。

2.  透蜡温度要恒定，不可忽高忽低。

3.  操作要迅速，力求在zui短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。