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质粒DNA质量如何评估才可靠?

更新时间:2015-01-13 浏览次数:2234

质粒抽提过程中有很多步骤会影响zui后的产量和质量,那么如何评估质粒DNA的产量和质量呢?

       目前使用分光光度法定量质粒DNA和通过琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA产率和质量的分析是两种zui常用的方法。

       溶液中的核酸浓度可通过260 nm的吸光度方便地进行计算。A260的数值处于0.1至1.0之间时测量结果具有良好的重复性,但当A260数值小于0.1或大于1.0的时候,结果的可重复性将显著下降。而且,3.0以上的读值是无法使用的,它可能会潜在导致对DNA质量的低估。因此,为了获得可靠的DNA分光光度定量结果,A260的读值需要处于0.1至1.0之间。当检测小量DNA时,使用琼脂糖凝胶电泳进行的定量分析可能更为可靠。

       造成较低的产率和质量的可能因素有很多。为了确定存在问题的环节,可于每一纯化步骤都保留一小部分样品,并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

制备样本

如各个实验方案和下列表格中所示,从澄清裂解液(样本1)、流出液(样本2)、QC洗涤缓冲液的混合组分(样本3)和QF/QN缓冲液洗脱产物(样本4)中各取出部分样品。使用1倍体积的异丙醇沉淀核酸,并使用70%的乙醇洗涤该沉淀,充分蒸干后重悬于10 μl pH8.0的TE缓冲液中。

表一 琼脂糖凝胶分析所需样本体积

样本

实验方案步骤

Midi

Maxi

Mega

Giga

(极低拷贝数质粒/科斯质粒) 
QIAGEN-tip 100

(极低拷贝数质粒/科斯质粒)QIAGEN-tip 500

1


240 μl

120 μl

120 μl

75 μl

600 μl

750 μl

2


240 μl

120 μl

120 μl

75 μl

50 μl

24 μl

3


400 μl

240 μl

160 μl

120 μl

200 μl

120 μl

4


100 μl

60 μl

22 μl

20 μl

50 μl

30 μl

(制备产物占样本量的百分比)

2%

0.40%

0.08%

0.02%

1%

0.20%

琼脂糖凝胶分析

在1%的琼脂糖凝胶*中,对于各个质粒纯化步骤中的对应样品各加入2 μl进行电泳。

以上信息来源于:

http://www.qiagen。。com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/reliability%20of%20dna%20quantification%20by%20spectrophotometry/ 

http://www.qiagen。。com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/agarose%20gel%20analysis%20of%20the%20purification%20procedure/ 

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