实验试剂

氯仿[重庆川东化工集团有限公司]

异丙醇[重庆川东化工集团有限公司]

无水乙醇[重庆川东化工集团有限公司]

异戊醇[上海化学试剂有限公司]

溴酚蓝[上海三爱思试剂有限公司]

二甲苯氰FF[Amersco Co.]

溴化乙锭[Amersco Co.]

饱和酚(pH 7.0 )[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

Taq DNA聚合酶[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

十二烷基肌氨酸钠[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

十二烷基硫酸钠[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

三轻甲基氨基甲烷[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

乙二氨四乙酸[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

饱和酚[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

100 bp Ladder DNA Marker [ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

琼脂糖[ Tianjin, H&Y Bio. Co. Ltd]

实验设备

SW-CJ-CO净化工作台[苏州净化设备有限公司]

FA1004A型电子天平[上海精天电子仪器厂]

70型离子纯水器[上海亚荣生化仪器厂]

SZ-93自动双重纯水蒸馏器[无锡科达仪器厂]

Mikro22R型高速冰冻离心机[Whatman Biometra]

5415D台式离心机[Eppendorf]

SS-325型高压灭菌器[Tomy Kogyo Co. Ltd]

YLE-2000数显式电热恒温水浴锅[上海跃进医疗器械厂]

pHS-4C型酸度计[成都方舟科技开发公司]

2002型振荡器[常州国华电器有限公司]

旋涡混合器[北方同正生物技术发展公司]

梯度热循环仪[Whatman biometra]

凝胶成像系统[上海四星生物技术实业有限公司]

MDF-382E型超低温保存箱[Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd]

DYY 12型电脑三恒多用电泳仪[北京六一仪器厂]

SmartSpec^TM3000核酸浓度分析仪[BIO-RAD]

实验材料

三色书虱采自野外，在实验室内建立种群。

实验步骤

1. 三色书虱总DNA的制备

   (1) 将50头书虱置于1.5mL的离心管中，用研棒在液氮环境中迅速将试虫充分研碎后加入200μL DNA提取裂解液。

   (2) 加入2.5μL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，50℃水浴2h(或培养过)。

   (3) 用等体积的平衡酚( Tris-HC1饱和酚，pH7.8 )，温和振荡摇匀(约20 min )，置20℃下保存5-10 min。

   (4) 4℃下离心l0min，将粘稠的水相移至洁净的离心管中。

   (5) 用等体积的酚:氯仿(1:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿各抽提取一次，离心(9000 r/min 10 min)取上清液。

   (6) 加入0.2倍体积的乙酸钠溶液(10 mol/L)和两倍体积的无水乙醇，-20℃放置2h使DNA充分沉淀。

   (7) 离心(12000 r/min 10 min )，弃上清液，沉淀用70%乙醇(4℃)洗涤两次。

   (8) 沉淀晾干(尽可能除去乙醇)后，将DNA重悬浮于TE缓冲液(pH8.0 )，于37℃中轻轻摇动有利于DNA重悬浮，使DNA充分溶解。

   (9) 加入Rnase至终浓度为lμg/mL，37℃保温lhr。

   (10) 按(4)~(9)抽提，沉淀，重悬DNA，在1μL双蒸灭菌水或TE中，4℃保存。

   (11) 取DNA4μL与2μ1 6x加样缓冲液混匀，点样到1.4%琼脂糖凝胶中，以2.5-5 v/cm电泳。

   (12)  0.5μg/mL的EB染色15-30min，紫外灯下观察拍照。

制备的DNA浓度用SmartSpec^TM3000核酸浓度分析仪检测，要求先将比色杯用100μL/次的无菌水反复清洗再测水的吸光度，之后将DNA液稀释50倍进行检测。要求OD=1.7左右。

2. 三色书虱体内共生细菌Wolbachia的Long PCR检测

Long PCR的20uL的反应体系包括:

wsp-F, 5'-TGG TCC AAT AAG TGA TGA AAG AAA CTA GCT A

wsp-R, 5'-AAAAAT TAAACG CTA CTC CAG CTT CTG CAC

用无菌水将反应体系补充至20μL

扩增条件为：94 ℃ 2min预变性后，94℃ l0sec，65℃ 30sec，68℃ lmin，10个循环；94℃ l0sec，65℃ 30sec，68℃ lmin。25个循环，每个循环在68℃下延长20sec。

扩增结束后取5μL的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测(电压5v/cm，电泳缓冲液为1 X TAE )，Bio-Rad凝胶成象系统下观察结果。

3. 序列的测定和分析

Wolbachia wsp基因序列由Long PCR产物上海生工直接测序获得。DNA序列检索和同源性比较利用BLAST工具(NCBI)。用程序中的zui大似然法(Maximum Likelihood method，ML)重建系统发生树，系统发生树中结点的自举检验置信度以1000次重复计算估计。对获得的三色书虱体内Wolbachia的wsp基因的片段进行系统发育分析，其它一些宿主体内的Wolbachia的wsp基因的片段则通过GenBank获得。