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蛋白质浓度测定(双缩脲法)

时间:2015-05-15 浏览次数:2467

实验原理


测定蛋白质的定量方法有很多,目前常用的有凯氏定氮法;比色法主要包括双缩脲法、Folin-酚试剂法及 染料结合法;紫外分光光度法等

双缩脲(Biuret)法:在碱性溶液中,双缩脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO—NH2),或与此相似的基团[如—CH2—NH2,—CS—NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO—NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比,可用比色法测定蛋白含量。与同样处理的蛋白标准液比较,经计算或查标准曲线即可求出血清总蛋白质含量。


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实验试剂

1.6mol/L氢氧化钠溶液  
      称取氢氧化钠(NaOH,优级纯)240g,用新鲜蒸馏水配制成1L,置室温贮存在密封的聚乙烯瓶里。
2.双缩脲试剂  
      称取未失结晶水的硫酸铜(CuSQ·5H20) 3.0g,溶于500m1新鲜蒸馏水中,加酒石酸钾钠(NaKC4H4O6.4H2O)9.0g,碘化钾(KI)5.0g,待安全
      溶解后,加入6mol/L氢氧化钠溶液100ml,zui后加蒸馏水至1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里,约稳定6个月。
3.蛋白标准液 
      可用商品血清蛋白标准液或定值质控血清为标准。亦可收集混合新鲜血清,用凯氏定氮法标定后,加叠氮钠防腐(叠氮钠的终浓0.5~1.0g/L),冰冻
      保存。

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实验设备

        恒温水浴箱、722(721)分光光度计、吸管、试管、坐标纸

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实验步骤


1.   配制20g/L蛋白标准液  如蛋白标准液浓度为70g/L,则取此液2m1,加入新鲜蒸馏水5ml,混匀即成。

2.   按表操作


    加入物(ml)  空白管    1    2    3    4    5 测定管
20g/L蛋白标准液     ~    0.1    0.2   0.3        0.4        0.5        ~   
蒸馏水    0.5     0.4    0.3   0.2    0.1   ~      0.4
待测样品液体   ~     ~     ~       ~      ~      ~        0.1
双缩脲试剂     3.0   3.0      3.0        3.0         3.0       3.0        3.0     
相当血液蛋白质(g/L)       ~       20    40    60    80   100    

      混匀,置37℃水浴10min(或25℃30min),用540nm波长比色,以空白管调零,读取各管吸光度。

3.   标准曲线绘制
      1—5为标准曲线管,测得吸光度后,以吸光度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。

4.   实验结果
      根据测定管吸光度,从标准曲线查找相对应的总蛋白浓度。 



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注意事项


1.双缩脲试剂中,加入酒石酸钾钠,Cu2 形成稳定的络合铜离子,以防止CuSO4·5H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸钾钠与CuSO4·5H20之比
      不低于3:1,加入KI作为抗氧化试剂。

2.双缩脲试剂要封闭贮存.防止吸收空气中的二氧化碳。

3.本法各种蛋白质的显色程度基本相同,重复性好,几乎不受温度影响,*缺点是灵敏度较低。

4.黄疸血清.严重溶血对本法有明显干扰。

5.本法绘制的标准曲线是一条通过原点的直线,在100g/L浓度之内呈良好的线性关系。

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