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柱离心法纯化质粒DNA

时间:2015-06-25 浏览次数:1813

实验原理


1. 离心柱结构:特殊硅基质吸附材料,特异性吸附DNA,而RNA与蛋白质穿过。

在正常情况下,核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜,以维持其水溶性。高浓度盐离子的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列,形成了疏水环境。在此环境中,核酸与硅胶膜能有效结合,而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。

2. 碱变性抽提的原理是在pH高于12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,破坏了碱基配对,导致双螺旋结构解开而变性,但闭环的质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当pH调至中性时,质粒DNA链迅速恢复到原来构型,仍保存于溶液中。而变性的染色体DNA不能再复性,通过离心,随不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,使两者得以分离


锚点

实验试剂


1. 试剂盒自带溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

2. 漂洗液

3. 结合缓冲液

4. 洗脱缓冲液

5. TE buffer


锚点

实验设备


1. 吸附柱

2. 取液枪

3. 离心机

4. 低压电泳仪

5. 水平电泳槽

6. 紫外透射仪


锚点

实验材料


带有质粒的大肠杆菌


锚点

实验步骤


1. 培养细菌:将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基,37℃培养12~16小时;

2. 取液体培养液3ml(1.5mlX2)于Eppendorf管中,10000r/min离心1min,去掉上清液,加入100ml 溶液I,充分混匀;置冰上;

3. 加入150ml 溶液II,加盖颠倒6-7次使之混匀,冰上放置1-2min;

4. 加入150 m l  溶液III,加盖后颠倒6-7次混匀,冰上放置5min;

5. 用台式高速离心机,12000r/min离心10min;

6. 吸附柱中加入420ul 结合缓冲液,将步骤5中的上清转移至吸附柱中,盖上收集管的盖子,混匀, 12000r/min离心1min;

7. 取下吸附柱,倒掉收集管中的液体,吸附柱放回同一收集管,向吸附柱中加入600ul 漂洗液 , 静置1 min,12000r/min离心30 s;

8. 重复步骤7一次;

9. 取下吸附柱,倒掉收集管中的液体,吸附柱放回同一收集管,12000r/min离心2min;

10. 吸附柱放入一个新的1.5ML离心管,在吸附柱的中央加40ul洗脱缓冲液或 TE buffer,室温放置3-5分钟。盖好盖子12000rpm 离心1分钟,收集质粒DNA溶液。

11. 取5ul 电泳检查,(100ml凝胶加入5ul 染料)。


锚点

注意事项


加样时要排出枪头中的空气,以免搅动液面。

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