产品分类

您的位置:首页 > 技术文章 > 成年猪胰岛分离纯化方法的优化

技术文章

成年猪胰岛分离纯化方法的优化

时间:2015-08-13 浏览次数:1615

实验试剂


胶原酶V,512 kut/mg(Sigma公司),DNA酶(Sigma公司),胎牛血清(Gibco公司),RPMI1640培养液(Gibco公司),Dextran(Pharmacia公司),Hanks平衡盐溶液(Gibco公司)。


锚点

实验设备


离心机,注射器,显微镜,超净工作台等。


锚点

实验材料


成年杂种猪,猪龄12 mo,体质量150 kg左右,猪被屠宰放血后,在相对无菌条件下迅速取出胰腺,保存于4℃ Hanks液中送至实验室,热缺血时间少于10 min,冷缺血时间少于90 min。


锚点

实验步骤


1. 胰岛分离

胰腺取回后,置于超净工作台上,快速去除胰周组织、脂肪、血管及外科被膜,保留固有被膜。从胰头、胰体交界部横断胰腺,找到主胰管,用20 G套管针插入,缝合线结扎,尾部远端亦结扎切断,每次均取约15-20 g组织,注入4℃含CaHanks液配制的复合胶原酶溶液(1.5 g/L,内含DNA酶0.3 g/L),注入量 = 胰质量×2,注射速度7 mL/min,3-4 min内完成,置入玻璃容器内,在38.5±0.1℃水浴中震荡消化,震速100 r/min,在消化过程中间断加入0.1 mmol/L的NaOH,使消化液pH值尽可能维持在7.8左右,从消化20 min开始每间隔4 min取样一次,双硫腙染色镜检,当胰腺组织被消化裂解成细沙状,镜检见大部分结构完整的胰岛从外分泌组织中脱落出来,立即用4℃冷Hanks液(含100 mL/L胎牛血清)终止消化,充分混匀后,用40目钢网过滤,收集消化后组织,4℃离心冼涤2次,去除脂肪等杂质细胞,取样镜检计数和观察消化后胰岛分离情况。
2. 胰岛纯化

用Dextran配制成密度为1.037,1.054,1.070,1.096,1.11 kg/L的不连续密度梯度液,依次将不连续密度梯度液各10 mL加入50 mL离心管中,zui后将洗涤后的消化组织每0.5 mL与1.037 kg/L密度梯度液10 mL混匀,小心移至离心管中液体上层,形成不连续密度梯度。将2-4个离心管置入低温离心机中,先800 r/min离心5 min,然后2 500 r/min离心15 min,离心后在1.096-1.054 kg/L之间收集纯化的胰岛,4℃离心洗涤2次。分别取样镜检计数,估计纯度和行生物学活性及组织学鉴定。
3. 胰岛计数和纯度测定

分离纯化后的组织悬液用双硫腙(双硫腙10 mg,无水乙醇3 mL,250 g/L氨水50 mL)进行染色,光镜下胰岛细胞团染成腥红色或红色,外分泌组织不着色,呈圆形、椭圆形或不规则形.在显微镜下计数直径≥50 mm的胰岛算出每克胰腺组织分离的胰岛当量数,纯度用内、外分泌组织量的比值来估计。
4. 胰岛生物学活性鉴定

将纯化后胰岛细胞悬液放置在显微镜下,用巴氏吸管吸取胰岛放入培养板中,每10个胰岛当量(每1个胰岛当量相当于直径150 mm的胰岛细胞团,IE)的成年猪胰岛(APIs)置入一个培养孔,6孔为1组,共4组.每组分别置入无糖培养基、含5.6 mmoL/L葡萄糖(低糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖(高糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖加10 mmoL/L茶碱(高糖 茶碱)的RPMI1640培养液中,置于37℃、含50 mL/L CO2的培养箱中孵育4 h,收集培养液,用胰岛素放免试剂盒(中科院原子能研究所)测定胰岛素含量.
5. 胰岛组织学检查

离心纯化后胰岛细胞悬液,收集胰岛组织,用无水酒精固定,石蜡包埋切片,HE染色检查胰岛组织结构完整性。
6. 统计学处理

所得数据以mean±SD表示,组间均数差异用t检验比较,P<0.05为有差异。

在线客服
返回顶部