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冷冻组织切片制作

时间:2015-08-27 浏览次数:1315

实验试剂


液氮,干冰,1%明胶,4%多聚甲醛,PBS,含1%NP-40的PBS,3%BSA/PBS稀释抗体,辣根过氧化物酶标记的二抗,DAB/金属盐试剂,3%过氧化氢,0.3%(W/V)氯化镍贮存液,Harris苏木精,乙醇


锚点

实验设备


载玻片,Whatman 1滤纸,低倍光学显微镜


锚点

实验材料


未受损伤的组织


锚点

实验步骤


1. 将未受损伤的组织切剖成小样本,约lcmXIcmX0.4cm。

2. 将标本放在卡片的一端。标记该卡片,将带有标本的一端浸入液氮中。60s后,取出标本并放在干冰上。修剪卡片,使其大小刚好比组织块稍大些,转入预冷的(-70℃)带有标记的小瓶中。

3. 切片前,用1%明胶包被洁净的载玻片。加热至50℃使明胶溶于水中,冷却,加入0.02%叠氮钠。将玻片浸入明胶溶液中30s,取出,自然干燥。

4. 按照仪器使用说明书,用低温恒温器制备冷冻切片。通常切片厚度在5-10gm之间。用包被过的载玻片收集切片。

5. 让切片自然干燥。浸入新鲜配制的4%多聚甲醛中2min。

6. 用PBS洗数次,放入含1%NP-40的PBS中5rain。用PBS洗数次。

7. 将带有组织切片的载玻片放在湿盒中。加合适稀释度的一抗,用含蛋白质的溶液如3%BSA/PBS稀释抗体。

单克隆抗体选用杂交瘤细胞培养上清(特异性抗体浓度为20-50gg/m1)。小鼠腹水、纯化的单克隆抗体和多克隆抗体,以及粗制的多克隆抗血清应该测试其稀释度,以使特异性抗体的浓度在0.1~10ug/m1之间。如果特异性抗体的浓度是未知的,则制备并测试初始制品的不同稀释度(1:10,1:100,1:1000和1:10 000)。

8. 将玻片置湿盒中于室温下孵育至少60min。对于某些反应来说,孵育时间可延长至24h,以增加其敏感性。

9. 用PBS洗3次,每次5min以上。

10. 加辣根过氧化物酶标记的二抗(特异性针对一抗)。这些试剂可以购自不同的经销商。如果二抗的确切用量是未知的,测试1:50—1:1000稀释的二抗。用含蛋白质的PBS稀释,如3%BSA/PBS。

11. 将样本置湿盒中,于室温下孵育30min。

12. 用PBS洗3次,每次5min以上。

13. 配制DAB/金属盐试剂。将6mg DAB溶于9ml 0.05mol/L Tris缓冲液(pH7.6)中。加lm[0.3%(W/V)氯化镍贮存液(可用相同浓度的氯化钴代替)。加0.1ml 3%过氧化氢。如果出现沉淀,用Whatman 1滤纸(或相似品)过滤。

14. 将上述溶液加到标本中。在低倍光学显微镜下观察。当形成足够的棕/黑色沉淀时,用水冲洗以终止反应。通常这一反应过程约需1-20min。

15. 加数滴Harris苏木精。孵育约5min。时间长短取决于染色的强度。

16. 用水轻柔冲洗。

17. 通过各级乙醇使标本依次脱水。在75%乙醇中孵育两次,每次3min,95%乙醇中2次,每次3min,100%乙醇中2次,每次3min。自然干燥。

18. 加一小滴DPX至标本上。小心在其上面放一盖玻片(1) 避免产生气泡。用纸巾去除多余的液体。DPX很快可以凝固,样品便可观察并照相。

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