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R&D Systems ELISA产品常见问题解答(2)

时间:2012-10-03 浏览次数:1643

R&D Systems ELISA产品常见问题解答

 

问:什么是R&D Systems的抗体配对?

答:R&D Systems的抗体配对是一个自己动手的产品。R&D Systems建议此产品的使用者在免疫测试的开发方面应很有造诣。使用者必须以经验为依据来决定捕获抗体和测试抗体的*浓度。R&D Systems的重组细胞因子并未经ELISA校正,所以在使用前必须经ELISA做质量校正。更多有关ELISA开发的信息可以参照我们的ELISA开发指网:http://www.rndsystems.com/tsg_detail_objectname_elisa_development.aspx

问:QuantikineQuantiGlo ELISA试剂盒有何不同?

答:R&D SystemsQuantikine牌子的ELISA试剂盒是一种比色法检测,需要一台标准读光仪配备有合适的滤光片可用于读数和光波长校正。QuantiGlo ELISA试剂盒采用了一种荧光底物,计数为光流明或相对光单位(RLU)。因此,QuantiGlo ELISA试剂盒需要有荧光读光仪。这种荧光读光仪需设置在:1.0分钟的滞待时间;1.0/孔的读数时间;累计状态;自动获取开启。R&D Systems使用Dynex Technologies的荧光读光仪。

问:普通Quantikine ELISA试剂盒同高灵敏Quantikine ELISA试剂盒有何不同?

答:高灵敏Quantikine ELISA试剂盒一般用于非常低量的细胞因子的检测,比如正常人(健康状态时)的血清和血浆。当普通Quantikine试剂盒一般检测不到(或几乎检测不到)正常人血清和血浆中的细胞因子,可选择高灵敏Quantikine。我们建议实验者先查阅文献资料来确定试验的测试范围以选择所需的试剂盒的种类。

问:R&D SystemsQuantikine试剂盒是否可用于组织匀浆(或其它未经检验的)样本?

答:很遗憾,R&D Systems尚未采用组织匀浆作为样本对Quantikine系列的试剂盒做效果验证。如果要决定试剂盒是否可用于未经检定的样本,实验者先做一个掺入和回收预试验。简单来说,实验者将样本分为两份:一份中掺入一定量的试剂标准,然后做一稀释系列(一般稀释到1:16),再将掺入过的一份同未掺入的一份相比。采用以下的公式来计算回收率(%):测试值(pg /毫升)/ 期待值(pg /毫升)x 100% = % 回收率。一般来说,回收率在80-120%可认为是可接受的。但是,可接受范围应由每一实验室自行决定。这种方法可用于检定未被R&D Systems检定的任何样本。我们还有更加详细的掺入和回收的实验步骤,可向我们的技术服务部索取。我们也可进一步查阅文献看一看是否有其他试验人员用我们的产品做过不同的样本,或不同的属种。

 

问:加入稀释剂是否会将样本进一步稀释?

答:因为稀释剂是加入到所有的孔中,标准和被测样本都被同样稀释,所以样本的浓度可从标准曲线读出,而不需作稀释调整。

问:我是否可将标准曲线的两端延伸?

答:在任何情况下,我们都不支持超出确定范围的实验结果。在我们确定的测试范围,我们保证实验结果的可重复性。

问:为什么不将测试范围延伸到所述的灵敏度?

答:灵敏度是统计中大于零的可测到的zui低值。它是通过本底信号和试验的可变性计算出来的。灵敏度是将20个零复制物的中值加两个标准差从标准曲线换算成分析物的浓度。而zui低标准是我们可以放心的、仍可与标准曲线成直线相关的zui低点,因而是可定量的。

问:Quantikine试剂盒中的试剂是否可互换?

答:如果试剂盒(RD1-, RD5-, RD6-)中的稀释剂有相同的组件号和批量号,它们可以互换。R&D Systems整个试剂盒的质量控制,就是说,我们不支持不同批号之间的替代。在任何情况下,微孔板和共轭物都不可互换。

问:Quantikine试剂盒中的洗液是否可互换?

答:如果组件号相同,洗液在相同类型的试剂盒之间(普通试剂盒之间,或高灵敏度试剂盒之间)是可以互换的。但是,普通Quantikine试剂盒中的洗液不能用于高灵敏度的试剂盒,在普通Quantikine试剂盒中的洗液含有磷酸,会干扰高灵敏度Quantikine试剂盒中由NADPH驱动的信号扩增。

问:在某些实验中为什么必须使用聚丙烯(polypropylene)的试管做标准稀释?

答:有些细胞分子会粘到玻璃或聚苯乙烯(polystyrene),但不粘聚丙烯。

问:在Quantkine试剂盒中没有足够的RD5校正物来稀释我的细胞上清液,我该怎么办?

答:你可用细胞培养液来做起始的稀释,直接移液到微孔板的zui终的1:10稀释可使用校正物来稀释。

问:我的Quantikine试剂盒中的RD1测试稀释剂看上去有沉淀物,可以用吗?

答:有些RD1测试稀释剂的确有不同程度的沉淀物。在这种情况下,我们在实验步骤手册中已做纪录。

问:标准曲线为什么要采用4-pl拟合?

答:R&D Systems在研发和质控我们绝大多数的Quantikine ELISA试剂盒时,采用4-相参数的曲线拟合(又名为4-plsigmoidal曲线拟合)。一般来说,它比log-log和直线有更好的曲线拟合。如果数据分析不可用4-pl的话,log-log是下一个的选择。

问:试验步骤中说要用500 rpm,我的摇床达不到。这个速度是正确的吗?

答:500 rpm使用的是0.12英寸的震荡轨道。如果你的震荡器用更大的震荡轨道,500 rpm的确是过快了。在这种情况下,你应根据R&D Systems的建议重新调整震荡速度。你可拿一个多余的96孔微孔板,加入洗液,洗液的量与实验时孔中的溶液量一致;封板后,调整震荡器的速度,直到液体在孔的上部剧烈旋转但不溅到封膜上或产生泡沫为止。

问:我有太大变异系数(CV)的问题,是怎么回事?

答:zui大但不是*的两个原因,可能是移液误差和清洗方式。你可参照我们的《如何成功地操作ELISA指导》,:http://www.rndsystems.com/tsg_detail_objectname_elisa.aspx

问:Quantikine ELISA试剂为什么需要做稀释?

答:主要有两个原因:一,在绝大多数的样本中细胞因子的含量非常高,如不经稀释,读数将高于标准曲线;二,也是zui普遍的原因我们建议做稀释,是将样本中的干扰或基质效应稀释掉。 

问:我是否可以在任何过夜步骤停止Quantikine试验、延长温育时间、或提高温育的温度?

答:R&D System不建议对任何Quantikine ELISA延长温育时间。而且,当实验步骤改变了,我, , 们无法保证Quantikine ELISA的实验结果。R&D System整个试剂盒的质量控制,就是说我们无法支持改变过的实验步骤,因为它们未经质量控制。延长温育时间、或提高温育温度以缩短温育时间会提高实验的本底(又名空白或零标准)。这样一来,样本和标准中的低量细胞因子会测不到,因为增高了的本底信号将从所有孔中的数值中差减。

问:我用了DuoSet ELISA开发系统,但几乎就没有颜色产生。那些步骤可能出了问题?

答:很多方面都会影响到颜色的产生。比如:

1)    BSA的干扰。选择不含脂肪酸的ELISA级别的BSA很重要,可以降低球蛋白对实验的干扰。R&D Systems建议使用Serological ProteinsBSA(目录#82-045)。

2)    非室温下的试剂在使用时会抑制信号;如果室温过低,信号也会被抑制。

3)    如果使用了未表明为高结合性ELISA”的微孔板,捕获抗体同微孔板的结合就不牢固,从而导致测试的颜色产生过低。

4)    任何试剂,如果配制出错、储藏不当、或已过期,都将出现这一问题。

5)    读板时使用的波长同低物的波长不一致。

问:我是否可以使用你们的抗体配对ELISA中的抗体,但用另一家公司的蛋白为标准?

答:若使用一家公司的抗体而用另一家公司的标准的带来问题是它们会有不同的免疫活性(或不同的抗体与重组蛋白的结合力)。这种现象的出现是因为作为标准的重组蛋白同作为抗体免疫原的重组蛋白在蛋白序列或折叠中会有所不同,如果蛋白序列或折叠的不同发生在抗体结合部位,就会引起抗体对重组蛋白标准的不识别或识别很差。

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