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DNA实验技术:分子克隆的常用载体

时间:2013-10-12 浏览次数:2824

DNA段的克隆需要合适的载体,载体或是质粒,或是噬菌体,或是病毒,通常大多经过人工改造[地的。作为载体必须具备两条件:一是该载体在细胞内必须能自主复制,即必须具备复制原点;二是该载体必须具备适合的酶切位点,且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条,保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆克隆,载体上常有筛选标记,如对抗菌素的抗性,某些基因产物的显色反应等。
 
一、质粒
常用的有pBR322,pUC系列质粒等。

(一)pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体,有2个抗药性基因(四环素和氨苄青霉素),一个复制起始点和多个用于克隆 的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时,它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆 之用。

(二)pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA质粒,有一个复制起点,一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点,多克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段,用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株(M15)时,因为由质粒表达的α-肽补充了大肠杆菌却失的α-肽,所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上,长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA,由于它破坏了α-肽的表达,因而在加入IPTG和X-gal的培养基,不能长出蓝色克隆,这就是所谓的蓝白筛选。

二、单链丝状噬菌体和噬粒

(一)大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体f噬菌体等,其基因组 均是单链闭环DNA分子,其中M13mp系列克隆载体是对野生型M13加以改造,插入了多克隆位点和LacZ基因后的载体,所以也是可以利用IPTG和X-gal作蓝白筛选的,M13感染大肠杆菌后,即在菌体内酶的作用下,以感染性单链DNA(正链)为模板,转变为双链DNA,称作复制型DNA(RF DNA)。一般当每一个细胞内有100-200个RF DNA拷贝时,即停止复制,产生有感染性的完整的单链丝状噬菌体并分泌离开菌体。感染M13的大肠杆菌可继续生长,并不发生裂解,但生长速度则较正常菌慢,取感染M13的细菌培养液离心,即可从菌体中提取RF DNA,供限制酶切割等分子克隆操作之用;从离心后的上清液中,可用聚乙二醇(PEG)沉出噬菌体颗粒,提取单链DNA(ss DNA)供DNA序列分析,体外定位突变等使用。

(二)噬粒(phagemid)在质粒DNA中插入一段单链噬菌体的复制起始点DNA,即构成了噬粒,如pGEM-3Zf(-)就是一种噬粒。噬粒可像一般质粒一样操作,但当需要制备单链DNA时,就需要在培养时加入辅助噬菌体,常用的辅助噬菌体有M13KO7和R408。培养好的菌液在离心除去菌体后,上清中加入PEG即可沉出含有单链DNA的颗粒。噬粒也常用于DNA序列分析和体外定位突变。分子克隆常用载体除了上述两类以外,还有 噬菌体和粘粒,详细情况可参阅有关资料。
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