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免疫组化专题介绍
更新时间：2012-10-08 浏览次数：1789
免疫组化基础知识
●免疫组织化学的概念
是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）。
●免疫组化的分类
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本zui常用、zui基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中的组织标本制作方法。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
多抗和单抗特性比较：
1.均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类。即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化学组成。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物。
2.稳定性。单抗的稳定性较差，对PH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多抗的稳定性则较好。
3.特异性。单抗是单一地针对抗原的某一决定簇，所以用它进行血清学反应时，特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应，而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应。
4.重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。
5.沉淀反应。多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。
●免疫组化常用的染色方法
根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法zui常用。
●免疫组化操作步骤
一 免疫组化（ LP 法）操作步骤 ：
1．切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行
2. 缓冲液洗 3min/2 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。）
6. 缓冲液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者zui终决定）
8. 缓冲液洗 5min/2 次。
9. 滴加 Primary Antibody Enhancer（ 增强子 ） , 在室温下孵育 20 分钟。
10.缓冲液洗 5min/2 次。
11.滴加 HRP Polymer（ 酶标二抗 ） ，在室温下孵育 30 分钟。
（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）
12.缓冲液洗 5min/2 次。
13．向 1ml DAB Plus Substrate （ 或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。）
14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。
二．免疫组化 （ 三步法 ） 操作步骤 ：
（ 1 ）石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ）3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（ 3 ）蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
（ 4 ）5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。
（ 5 ）PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 6 ）滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
（ 7 ）PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 8 ）滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
（ 9 ）PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 10 ）显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ）
（ 11 ）自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
三. 冰冻切片免疫组化染色步骤：
冰冻切片 4-8um ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
一 免疫组化（ LP 法）操作步骤 ：
1．切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行
2. 缓冲液洗 3min/2 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。）
6. 缓冲液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者zui终决定）
8. 缓冲液洗 5min/2 次。
9. 滴加 Primary Antibody Enhancer（ 增强子 ） , 在室温下孵育 20 分钟。
10.缓冲液洗 5min/2 次。
11.滴加 HRP Polymer（ 酶标二抗 ） ，在室温下孵育 30 分钟。
（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）
12.缓冲液洗 5min/2 次。
13．向 1ml DAB Plus Substrate （ 或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。）
14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。
二．免疫组化 （ 三步法 ） 操作步骤 ：
（ 1 ）石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ）3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（ 3 ）蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
（ 4 ）5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。
（ 5 ）PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 6 ）滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
（ 7 ）PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 8 ）滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
（ 9 ）PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 10 ）显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ）
（ 11 ）自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
三. 冰冻切片免疫组化染色步骤：
冰冻切片 4-8um ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
从实验结果而言，免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析，图片的确定与选取，相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容，只有严格的实验设计，标准的实验操作，专业化的结果分析才能更好的满足客户的要求，这点对于形式为腹水，上清，培养液之类的抗体显得更为重要。关于上述服务内容应该在实验开始前由双方明确，一般而言，客户方实验前应提出需要什么样的结果与分析，例如是简要还是详细的描述实验结果，需要实验数据否，图片的数量与规格等。如果为双盲试验或有第三方参与，则事先申明。
●石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？
组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是PH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是PH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。
免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面：
（1）恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；
（2）确定转移性恶性肿瘤的原发部位；
（3）对某类肿瘤进行进一步的病理分型；
（4）软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是*的；
（5）发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。
（6）为临床提供治疗方案的选择。
（5）发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。
（6）为临床提供治疗方案的选择。
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