细胞表面抗原染色
更新时间：2013-04-24 浏览次数：1550
3． 当染色的时候，固定或延迟分析可能降低某些抗体的荧光信号。为了得到更好的结果，染色后应该马上分析。
注意：流式细胞染色实验中，所有实验条件的优化都很重要。关键参数包括靶细胞、抗体效价以及动力学。
材料：12×75 mm的圆底试管（Falcon Cat.No.2008）或96孔圆底微量滴定板（Falcon Cat.No.3910），原始抗体（既未纯化也未偶联），
缓冲液： eBioscience流式染色缓冲液（Cat.No.00-4222），流式鞘液
半个小时细胞准备，半个小时抗体稀释和样品准备，半个小时到一个小时孵育过程，半个小时以上的运行和分析时间
1． 采集组织（脾，淋巴结，胸腺），用注射器的活塞挤压以制成单细胞悬液，此过程用10ml的染色缓冲液；
2． 转移到50ml的圆锥形试管中并使大块沉淀到试管底部或者通过尼龙滤网过滤，得到单细胞悬液；
3． 4℃ 离心沉淀细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清；
4． 如果上过程采集的脾，还用用RBC裂解，否则进入下一步；
6． 再次离心细胞，弃掉上清，重悬细胞使其细胞数达到2×107 个/ml；
1． 用50 ?l染色液稀释前面选的抗体，分装到每个试管或微量滴定板的孔中。吸取50 ?l染色液到阴性对照试管中。在滴定实验中，滴定范围是2-0.03?g/百万个细胞；
2． 加入50 ?l细胞悬液（相当于106个细胞）于每个试管或孔中，轻轻混匀；
3． 避光冰浴20分钟。注意：某些抗体可能需要更长的孵育时间，用预实验摸索实验条件；
4． 孵育之后，加入染色液（试管2ml，微量滴定板200?l）；
5． 4℃ 离心沉淀细胞5分钟（300-400g），吸掉上清；
a.如果用荧光标记的抗体，用500 ?l染色液重悬已染色的细胞沉淀物，然后在流式细胞仪上分析。
注意：如果同时加入多种荧光标记的抗体进行染色，孵育和洗涤的步骤和上面的一样。注意加入荧光抗体后的所有步骤都要在低温避光的条件下进行。
12×75 mm的试管（Falcon Cat.No.2008）
eBioscience 流式染色液（Cat.No.00-4222）
eBioscience 1×RBC Lysis Buffer（Cat.No.00-4333）
流式仪试验时间半个小时抗体稀释和样品准备半个小时到一个小时染色过程半个小时以上的运行和分析时间方法
1． 用50?l染色液稀释未偶联或偶联生物素的抗体，分装到每个试管中。分装50?l染色液到干净的或阴性对照试管中。滴定ioscience抗人的偶联荧光素的抗体20?l于每个样品中；
3． 避光室温孵育15-30分钟。注意：某些抗体结合力较低可能需要更长的孵育时间。预试验摸索这些条件。
4． 加2ml 1×RBC（预温到室温）于每个试管中，轻轻混匀；
5． 避光室温孵育样品10分钟。用1×RBC 孵育不要超过15分钟。
6． 室温离心样品（300-400g），抽吸掉上清液，然后用2ml 染色液洗一次。
a. .如果用荧光标记的抗体，用500 ?l染色液重悬已染色的细胞沉淀物，然后在流式细胞仪上分析。
注意：如果同时加入多种荧光标记的抗体进行染色，孵育和洗涤的步骤和上面的一样。注意加入荧光抗体后的所有步骤都要在低温避光的条件下进行。
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