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EMSA凝胶迁移

时间:2015-05-15 浏览次数:2192

实验原理


凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术zui初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。 


锚点

实验试剂


重要试剂:

Boitin-N4-CTP           (invitrogen    # 15918-18)

TdT                          (NEB        # M0252L)

Poly(dI.dC)               (sigma       #P4929)

Hybond-N 尼龙膜       (Amersham   #RPN303B)

发光底物                    (宁波    唯奥)

缓冲液:

Buffer A  (store at 4℃)

Hepes  (pH7.9)                  10mM

KCl                                    10mM

EDTA                                0.1mM

DTT(fresh added)                 1mM

PMSF(fresh added)            0.5mM


Buffer B (store at 4℃)

0.5M EDTA in PBS (pH7.4)


Buffer C  (store at 4℃)

Hepes  (pH7.9)                 20mM

NaCl                                  0.4M

EDTA                                 1mM

DTT(fresh added)                1mM

PMSF(fresh added)              1mM


Buffer I  (store at RT)

Tris (pH7.5)             0.1M

NaCl                           1M

MgCl2                       2mM    


Buffer II (pH7.5) (store at RT)

马来酸                     100mM

NaCl                       150mM


Buffer III  (store at RT)

Tris(pH9.5)              100mM

NaCl                        100mM

MgCl2                        50mM


Blocking Buffer (store at 4℃)

0.3%Tween-20, 0.3%Triton X-100, 5%BSA in Buffer I


Wash Buffer

0.3%Tween-20 in Buffer II


20×SSC (1L  pH7.0)

NaCl                 175.3g

柠檬酸钠              88.2g

10×Binding Buffer (store at -20℃) [在公司(碧云天)购买:5×binding buffer,内含Poly(dI.dC)]

Tris (pH7.5)                  0.1M

KCl                               0.5M

DTT                            10Mm


Poly(dI.dC) (store at -20℃)

1mg/ml in  TE (pH7.5)


SA-HRP(储存液store at -20℃ 工作液store at 4℃)

1mg/ml in  50%PBS (pH7.2) 50%Glycerin


5×TBE  (5L)

EDTA                         18.612g

硼酸                       139.1175g

Tris                         272.565g

  

5×TdT Reaction Buffer (store at -20℃) (pH7.2)

Sodium cacodylate              0.5M

CoCl2                               10mM        

TCEP                                  1mM


Biotin-N4-CTP (store at -20℃)

Biotin-N4-CTP               50mM

Tris (pH7.5)                  10mM            

EDTA                              1mM




锚点

实验步骤


生物素标记探针:
1. 按如下顺序加入反应物,温和混匀,切勿涡漩    

超纯水                                   25μl

5×TdT Reaction Buffer           10μl

探针(1μM)                               5μl

Biotin-N4-CTP                         5μl

TdT (2U/μl)                             5μl

37℃反应30分钟

2. 加入2.5μl 0.2M EDTA终止反应;

3. 加入50μl 酚:氯仿,短暂涡漩,15000g离心2min,保留上层水相,-20℃保存;

4. 结合反应前等体积混合两条标记引物,90℃退火引物,并自然冷却至4℃,待用。

 

抽提核蛋白:

1. 2~3×106密度铺60mm细胞培养板,培养约12h;

2. 移去细胞培养基,PBS洗细胞一次;

3. 加入1mL Buffer B 于培养板,将细胞刮下收集于1.5mL离心管;

4. 1000g 离心2min,吸去上清;

5. 加入160μl Buffer A,重悬沉淀,冰育20min;

6. 加入含2.5%NP-40的Buffer A,涡漩10s,4℃ 15000g 离心5min;

7. 吸去上清,加入40μl Buffer C,4℃涡漩25min,4℃ 18000g 离心5min;

8. 吸取2μl上清采用Bradford法测蛋白质浓度,其余储存于-80℃。



配置非变性聚丙烯酰胺凝胶(以6%浓度为例)

5×TBE                         1mL

30%Ac-Bi                     2mL

40%Glycerin(甘油)   625μL

DDW (双蒸水)      6.125mL

10%AP                      150μL

10%TEMED                100μL

以预冷为4℃的0.5×TBE为电泳缓冲液,100V预电泳30-60min(时间不定,跑到溴酚蓝占整块胶的三分之二处)


EMSA(参考PIERCE公司试剂盒)

1. 特异性的证明

使用的探针序列需证明其是否与目的蛋白特异性结合,确定目的条带的位置。

按照“步骤"中的体系,做以下四组平行结合实验:

(在加入ddw,10×binding buffer,Poly(dI.dC)的基础上)

 1) 生物素标记的探针

 2) 蛋白质粗提物

 3) 蛋白质粗提物+200倍浓度的非标记的同种探针(即冷探针)

 4) 蛋白质粗提物+200倍浓度的非标记的突变探针(可以设计多种突变类型的探针,看是否能竞争结合)

 5) 蛋白质粗提物+抗体

室温反应10min,然后加入生物素标记的探针;

室温继续反应20min,做EMSA检测。

结果分析,如果出现如下实验结果

1) 显示游离探针位置

2) 显示游离探针位置和迁移带位置

3) 只有游离带,没有迁移带

4) 和2)带型一致

则证明探针与目的蛋白为特异性结合。


步骤:

1. 按如下顺序加入反应物,温和混匀(20μl体系)

    ddw                             ――

    10×binding buffer         2μl

    Poly(dI.dC)                   1μl    (以上文字已说明由公司定)

    核蛋白粗提物                  4-10μg(温和混匀)

    生物素标记的探针            0.5μl

室温反应20min,加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl,上样10-20μl,100V电泳至溴酚蓝于三分之二处。


2. 电转前将尼龙膜浸泡于0.5×TBE至少10min

以预冷的0.5×TBE为电转缓冲液100V转胶于尼龙膜上,45min。

3. UV BOX下,以贴近膜一面面向紫外光源,以254nm激发光交联15min(紫外交联仪1200能量,照2次)


4. 加入25mLBlocking Buffer,以约70rpm在脱色摇床上封闭30min


5. 将SA-HRP以1:30000-50000稀释于12mL Blocking Buffer,脱色摇床70rpm作用20min

(洗膜过程全部在脱色摇床上进行, 约100-140prm)


6. Buffer II  25ml,  5min

7. wash buffer 25ml  15min

8. Buffer III  25ml  5min×2次

9. 0.1%SDS in 2×SSC, 5min×2次

10. 0.1%SDS in 1×SSC, 10min×2次

11. 0.1%SDS in 0.5×SSC, 5min×2次

12. 将膜于滤纸稍适吸干,加入到以1:20稀释的发光反应液(宁波奥唯),作用1-5 min,将尼龙膜封于保鲜膜中(避免褶皱和气泡的产生),暗室曝光1-5min,检测信号。

 


锚点

注意事项


使用此protocol效果图


 


图1. 用10ng/ml的mLT-?刺激MEF细胞,分别刺激0、15、30、60、120min,检测NF-?B的量。(p:probe only. 只加入标记探针未加入核蛋白抽提物)

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