实验原理

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术zui初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。 

实验试剂

重要试剂：

Boitin-N4-CTP           (invitrogen    # 15918-18)

TdT                          (NEB        # M0252L)

Poly(dI.dC)               (sigma       ＃P4929)

Hybond-N 尼龙膜       (Amersham   ＃RPN303B)

发光底物                    (宁波    唯奥)

缓冲液：

Buffer A  (store at 4℃)

Hepes  (pH7.9)                  10mM

KCl                                    10mM

EDTA                                0.1mM

DTT(fresh added)                 1mM

PMSF(fresh added)            0.5mM

Buffer B (store at 4℃)

0.5M EDTA in PBS (pH7.4)

Buffer C  (store at 4℃)

Hepes  (pH7.9)                 20mM

NaCl                                  0.4M

EDTA                                 1mM

DTT(fresh added)                1mM

PMSF(fresh added)              1mM

Buffer I  (store at RT)

Tris (pH7.5)             0.1M

NaCl                           1M

MgCl₂                       2mM    

Buffer II (pH7.5) (store at RT)

马来酸                     100mM

NaCl                       150mM

Buffer III  (store at RT)

Tris(pH9.5)              100mM

NaCl                        100mM

MgCl₂                        50mM

Blocking Buffer (store at 4℃)

0.3％Tween-20, 0.3%Triton X-100, 5%BSA in Buffer I

Wash Buffer

0.3％Tween-20 in Buffer II

20×SSC (1L  pH7.0)

NaCl                 175.3g

柠檬酸钠              88.2g

10×Binding Buffer (store at -20℃) [在公司（碧云天）购买：5×binding buffer,内含Poly(dI.dC)]

Tris (pH7.5)                  0.1M

KCl                               0.5M

DTT                            10Mm

Poly(dI.dC) (store at -20℃)

1mg/ml in  TE (pH7.5)

SA-HRP(储存液store at -20℃ 工作液store at 4℃)

1mg/ml in  50%PBS (pH7.2) 50%Glycerin

5×TBE  (5L)

EDTA                         18.612g

硼酸                       139.1175g

Tris                         272.565g

5×TdT Reaction Buffer (store at -20℃) (pH7.2)

Sodium cacodylate              0.5M

CoCl2                               10mM        

TCEP                                  1mM

Biotin-N4-CTP (store at -20℃)

Biotin-N4-CTP               50mM

Tris (pH7.5)                  10mM            

EDTA                              1mM

实验步骤

生物素标记探针:
1. 按如下顺序加入反应物，温和混匀，切勿涡漩    

超纯水                                   25μl

5×TdT Reaction Buffer           10μl

探针(1μM)                               5μl

Biotin-N4-CTP                         5μl

TdT (2U/μl)                             5μl

37℃反应30分钟

2. 加入2.5μl 0.2M EDTA终止反应；

3. 加入50μl 酚：氯仿，短暂涡漩，15000g离心2min，保留上层水相，－20℃保存；

4. 结合反应前等体积混合两条标记引物，90℃退火引物，并自然冷却至4℃，待用。

抽提核蛋白：

1. 2~3×10⁶密度铺60mm细胞培养板，培养约12h；

2. 移去细胞培养基，PBS洗细胞一次；

3. 加入1mL Buffer B 于培养板，将细胞刮下收集于1.5mL离心管；

4. 1000g 离心2min，吸去上清；

5. 加入160μl Buffer A，重悬沉淀，冰育20min；

6. 加入含2.5％NP-40的Buffer A，涡漩10s，4℃ 15000g 离心5min；

7. 吸去上清，加入40μl Buffer C，4℃涡漩25min，4℃ 18000g 离心5min；

8. 吸取2μl上清采用Bradford法测蛋白质浓度，其余储存于-80℃。

配置非变性聚丙烯酰胺凝胶(以6％浓度为例)

5×TBE                         1mL

30％Ac-Bi                     2mL

40％Glycerin（甘油）   625μL

DDW （双蒸水）      6.125mL

10%AP                      150μL

10%TEMED                100μL

以预冷为4℃的0.5×TBE为电泳缓冲液，100V预电泳30-60min（时间不定，跑到溴酚蓝占整块胶的三分之二处）

EMSA（参考PIERCE公司试剂盒）

1. 特异性的证明

使用的探针序列需证明其是否与目的蛋白特异性结合，确定目的条带的位置。

按照“步骤"中的体系，做以下四组平行结合实验：

（在加入ddw，10×binding buffer，Poly(dI.dC)的基础上)

 1) 生物素标记的探针

 2) 蛋白质粗提物

 3) 蛋白质粗提物＋200倍浓度的非标记的同种探针（即冷探针）

 4) 蛋白质粗提物＋200倍浓度的非标记的突变探针（可以设计多种突变类型的探针，看是否能竞争结合）

 5) 蛋白质粗提物＋抗体

室温反应10min，然后加入生物素标记的探针；

室温继续反应20min，做EMSA检测。

结果分析，如果出现如下实验结果

1) 显示游离探针位置

2) 显示游离探针位置和迁移带位置

3) 只有游离带，没有迁移带

4) 和2)带型一致

则证明探针与目的蛋白为特异性结合。

步骤：

1. 按如下顺序加入反应物，温和混匀（20μl体系）

    ddw                             ――

    10×binding buffer         2μl

    Poly(dI.dC)                   1μl    （以上文字已说明由公司定）

    核蛋白粗提物                  4－10μg（温和混匀）

    生物素标记的探针            0.5μl

室温反应20min，加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl，上样10－20μl，100V电泳至溴酚蓝于三分之二处。

2. 电转前将尼龙膜浸泡于0.5×TBE至少10min

以预冷的0.5×TBE为电转缓冲液100V转胶于尼龙膜上，45min。

3. UV BOX下，以贴近膜一面面向紫外光源，以254nm激发光交联15min（紫外交联仪1200能量，照2次）

4. 加入25mLBlocking Buffer，以约70rpm在脱色摇床上封闭30min

5. 将SA-HRP以1:30000-50000稀释于12mL Blocking Buffer，脱色摇床70rpm作用20min

(洗膜过程全部在脱色摇床上进行, 约100-140prm)

6. Buffer II  25ml,  5min

7. wash buffer 25ml  15min

8. Buffer III  25ml  5min×2次

9. 0.1%SDS in 2×SSC, 5min×2次

10. 0.1%SDS in 1×SSC, 10min×2次

11. 0.1%SDS in 0.5×SSC, 5min×2次

12. 将膜于滤纸稍适吸干，加入到以1:20稀释的发光反应液(宁波奥唯)，作用1-5 min，将尼龙膜封于保鲜膜中（避免褶皱和气泡的产生），暗室曝光1-5min，检测信号。

注意事项

使用此protocol效果图

图1. 用10ng/ml的mLT-?刺激MEF细胞，分别刺激0、15、30、60、120min，检测NF-?B的量。（p：probe only. 只加入标记探针未加入核蛋白抽提物）