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PCR扩增产物鉴定与纯化1

时间:2015-06-02 浏览次数:1329

实验原理


琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。(原理参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验)

本实验使用了TaKaRa公司的胶纯化试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit),该试剂盒是从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统,结合DNA制备膜技术,具有、快速、方便的特点,全套操作只需30min便可完成。使用该试剂盒每次可纯化得到多至10μg的DNA片段(100bp~30kb),回收率高达50~80%。本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高,完整性好,可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。

经胶纯化试剂盒回收的DNA片段采用-20℃低温保存,延缓DNA的降解。



锚点

实验试剂


1. PCR扩增产物

2. Agarose Gel DNA Purification Kit (TaKaRa)

3. 琼脂糖

4. 1×TAE

5. 6×Loading Buffer

6. DNA Marker 2000


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实验设备


1. 琼脂糖凝胶电泳系统

2. 紫外透射仪

3. 台式离心机

4. 移液枪(配套枪头)

5. -20℃低温冰箱

6. 分析天平



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实验材料


1. 单面刀片

2. 纯化试剂盒

3. 1.5mL离心管

4. 超纯水(无菌)



锚点

实验步骤


1. 使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。(参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验)

2. 在紫外灯下切出含有目的DNA(约600bp)的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶,尽量减小凝胶体积,提高DNA回收率。

     注意:切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下,以防止DNA损伤。

3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间,提高DNA的回收率。

4. 称量胶块重量,计算胶块体积。计算胶块体积时,以1mg=1μL进行计算。

5. 向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer,DR-I Buffer的加量如下表:


   凝胶浓度    DR-I Buffer 使用量 
    1%      3个凝胶体积量
    1%-1.5%      4个凝胶体积量
    1.5%-2%      5个凝胶体积量


6. 均匀混合后75℃加热,融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热)。此时应间断振荡混合,使胶块充分融化(约6~10分钟)。

     注意:胶块一定要充分融化,否则将会严重影响DNA的回收率。

7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer,均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时,应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。

8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

9. 将上述操作7的溶液转移至Spin Column中,12000 rpm离心1min,弃滤液。

     注意:如将滤液再加入Spin Column中离心一次,可以提高DNA的回收率。

10. 将500 μL的Rinse A加入Spin Column中,12000 rpm离心30s,弃滤液。

11. 将700 μL的Rinse B加入Spin Column中,12000 rpm离心30s,弃滤液。

12. 重复操作步骤11。

13. 将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上,在Spin Column膜的中央处加入25 μL的灭菌蒸馏水或Elution Buffer,室温静置1min。

     注意:使用加热至60℃的灭菌蒸馏水或Elution Buffer有利于提高洗脱效率。

14. 12000 rpm离心1min洗脱DNA。

                 -20℃低温保存纯化的目的DNA片段。

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