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PAGE胶制备方法

时间:2015-06-08 浏览次数:880

实验试剂


1. 5x样品缓冲液(10ml):0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油,2ml 10%的SDS,0.5ml巯基乙醇,1ml 1%溴酚蓝,0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。

2. 凝胶贮液:在通风橱中,称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水溶解后,定容到100ml。过滤后置棕色瓶中,4℃保存,一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液: Tris 36.3g ,加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解,调pH8.9,定容至100ml, 4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液: Tris 5.98g ,加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解,调pH6.7,定容至100ml, 4℃保存。

5. TEMED(四乙基乙二胺)原液

6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制)

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液:称取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水约900ml,调pH8.3后,用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存,临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250,溶于200ml蒸馏水中,慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸,zui后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。


锚点

实验设备


电泳仪,电泳槽,水浴锅,摇床。


锚点

实验步骤


1.   样品制备

将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5-10min,取上清点样。

2.   分离胶及浓缩胶的制备

1)   将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净,用ddH2O冲洗数次,再用乙醇擦拭,晾干;

2)   将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer,按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板;

3)   按如下体积配制10%分离胶8.0 ml,混匀;

ddH2O 3.0 ml

1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml

30% Acr-Bis 2.8 ml

10% SDS 80 ul

10%AP 56 ul

TEMED 6 ul

4)   向玻璃板间灌制分离胶,立即覆一层重蒸水,大约20 min后胶即可聚合;

5)   按如下体积配制6%浓缩胶3.0 ml,混匀;ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30% Acr-Bis

2.0 ml 400 ul 600 ul

10% SDS 10% AP TEMED

36ul 24ul 4ul

6)   将上层重蒸水倾去,滤纸吸干,灌制浓缩胶,插入样品梳;

7)   装好电泳系统,加入电极缓冲液,上样20 μl;

8)   稳压200V,溴酚蓝刚跑出分离胶时,停止电泳,约需45 min~1hr.

9)   卸下胶板,剥离胶放入染色液中,室温染色1~2 hr;加入脱色液,置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液(10 ml 冰乙酸;45 ml乙醇;45 ml蒸馏水)至完全脱净。

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