实验试剂

1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50％甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1％溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。

5. TEMED（四乙基乙二胺）原液

6.10％过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70％的过氯酸，zui后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

实验设备

电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。

实验步骤

1.   样品制备

将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，取上清点样。

2.   分离胶及浓缩胶的制备

1)   将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；

2)   将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板；

3)   按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；

ddH2O 3.0 ml

1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml

30％ Acr-Bis 2.8 ml

10％ SDS 80 ul

10％AP 56 ul

TEMED 6 ul

4)   向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；

5)   按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30％ Acr-Bis

2.0 ml 400 ul 600 ul

10％ SDS 10％ AP TEMED

36ul 24ul 4ul

6)   将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；

7)   装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;

8)   稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr.

9)   卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至*脱净。