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动物组织块DNA的提取

时间:2015-06-08 浏览次数:885

实验原理


DNA是一切生物细胞的重要组成成分,主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞;苯酚和氯仿可使蛋白质变性,用其混合液(酚:氯仿:异戊醇)重复抽提,使蛋白质变性,然后离心除去变性蛋白质;RNase降解RNA,从而得到纯净的DNA分子。


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实验试剂


1.生理盐水
2.十二烷基硫酸钠(SDS)
3.三羟甲基氨基甲烷(Tris)
4.乙二胺四乙酸(EDTA)
5.饱和酚
6.氯仿
7.异戊醇
8.无水乙醇
9.75%乙醇
10.蛋白酶K
11.RNase酶(

试剂配制
1.Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml
配制方法:
40ml双蒸水,6.057g固体Tris放入烧杯中溶解,用浓盐酸调PH值到8.0,转移到50ml容量瓶中,加入双蒸水定容,摇匀后,转到准备好的输液瓶中,贴上标签,高压灭菌后,降至室温,4℃保存备用。
2.生理盐水: 0.85%NaCL 100ml
配制方法:
在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL,加水定容至100ml,摇匀后,转到准备好的输液瓶中,贴上标签,高压灭菌后,降至室温,4℃保存备用。
3.EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml
配制方法:
将9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml双蒸水,用1g的NaOH颗粒(慢慢逐步加入)调PH值到8.0,用50ml容量瓶定容,如果EDTA难溶,先加NaOH溶解,然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。
4.TES缓冲液(释放DNA) 100ml
配制方法:
将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水,在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0),加定容至100ml, 摇匀后,转到准备好的输液瓶中,贴上标签,高压灭菌后,降至室温,4℃保存备用。
5.10% SDS(变性剂破细胞壁)100ml
配制方法:
将10g的十二烷基硫酸钠(SDS)溶解于80ml双蒸水于68℃加热溶解,用浓HCl调至PH=7.2,定容至100ml,摇匀后,转到准备好的输液瓶中,贴上标签,4℃保存备用。
6.蛋白酶K(降解蛋白质):20mg/mL 无菌三蒸水溶解。
7.RNA酶(降解RNA)
配制方法:
将胰RNA酶(RNA酶A)溶于10mmol/L的Tris·CL(PH7.5)、15mmol/LNaCL中,配成10mg/ml的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,分装成小份存于–20℃。
8.氯仿:异戊醇=24:1 100ml
按24:1的比例加入氯仿、异戊醇,摇匀,转到准备好的瓶中,贴上标签,4℃保存备用。
9.TE缓冲液(溶解DNA) PH8.0 50ml
配制方法:
将0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0) 、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0) 加入到50ml的容量瓶中,调PH8.0定容至50ml摇匀后,转到准备好的瓶中,贴上标签,高压灭菌后,降至室温,4℃保存备用。


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实验设备


1.高速离心机
2.烘箱
3.冰箱
4.水浴锅
5.微量移液器
6.高压灭菌锅

7.手术剪刀、镊子、吸水纸
8.微量取液器
9.研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔等


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实验材料


动物组织块


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实验步骤


1.组织块解冻,用生理盐水洗去血污,剪取约0.5g组织,放入1.5ml离心管中,剪碎。
2.加入0.45ml TES混匀,再加入50ul SDS(10%),5.0ul蛋白酶K(20mg/ml),充分混匀后,于56°C保温4-6h,每2h摇1次。
3.放置到室温,加入等体积饱和酚(500ul),颠倒混匀,10000r/m,离心10m,分离水相和有机相,小心吸取上层含核酸的水相,到一个新的1.5ml离心管。
4.加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),颠倒混匀,10000r/m,离心10分钟,取上层转移到新的1.5ml离心管中。
5.加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),颠倒混匀,10000r/m,离心10分钟,取上层清液到一个新的1.5ml离心管。
6.加入2.5倍体积的-20°C预冷的无水乙醇沉淀DNA,观察现象。
7.12000 r/m,离心10分钟,弃乙醇。
8.-20°C保存的75%乙醇洗涤,10000 r/m,离心5分钟,去乙醇,55°C干燥DNA。
9.加入适量TE溶解DNA(具体依DNA的多少而定),-20°C保存备用。


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注意事项


1.抽提每一步用力要柔和,防止机械剪切力对DNA的损伤。
2.取上层清液时,注意不要吸起中间的蛋白质层。
3.乙醇漂洗去乙醇时,不要荡起DNA。
4.离心后,不要晃动离心管,拿管要稳,斜面朝外

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