实验试剂

1. 75%酒精

2. 5% FCS-RPMI-1640*培养液与RPMI-1640*培养液

3. ConA或PHA

4. IL-1标准品：倍比稀释成至少6个不同浓度值。

实验设备

1. ³H-TdR、β-液闪汁数仪，微量细胞收集仪

2. 解剖刀、剪、单皿、研磨工具(玻璃匀浆器，不诱钢网或者毛玻璃片，用于研磨小鼠胸腺)

3. 96孔细胞培养板

4. 刻度吸管，毛细吸管，刻度离心管、离心机、细胞计数板，倒置显微镜，加样器(头)，50%CO₂培养箱，超净工作台

实验材料

1. 小鼠：BALB/C或C57BL/6小鼠，6-10周龄，雌雄均可。

2. IL-1待测样品：倍比稀释成至少6个不同浓度值。

实验步骤

1. 准备工作与ConA或PHA亚适剂量的确定

测定样品前必须作ConA或PHA的剂量曲线，观察其对小鼠胸腺细胞增殖的影响，选择一个既能够激活胸腺细胞，但又不引起其明显增殖的合适剂量，即亚适剂量。

   1) 在96孔培养板各孔中加入小鼠胸腺细胞，100μl/孔；

   2) 加入不同浓度的ConA(或PHA)，100μl/孔，使其终浓度分别为0.5μg/ml，1μg/ml ，2μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，各设三复孔，以不加ConA的培养液作对照；

   3) 置37℃，5% CO₂培养箱中培养72h，收获前12h加入³H-TdR，0.5μci/50μl/孔；

   4) 用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上，用β-液闪计数仪测定各孔cpm值；数据(cpm)以三个复孔平均值 标准差表示，

   5) 数据(cpm)以三个复孔平均值 标准差表示，绘制ConA剂量曲线，据此选择亚适剂量，通常为0.2-2.0μg/ml)(终浓度)；

2. 操作步骤

   1) 拉颈处死小鼠，浸泡于75%酒精中3-5min，消毒处理；

   2) 无菌操作取出小鼠胸腺，放入含有RPMI-1640*培养液的平皿中；

   3) 将胸腺剪碎(或研磨工具磨碎)，无菌纱布过滤，制成单个胸腺细胞悬液；

   4) 用PRMI-1640*培养液洗涤上述细胞2次，1500r/min离心10min，然后用5% FCS-RPMI-1640*培养液调细胞浓度为1.5×10⁷/ml；

   5) 在96孔培养板各孔中加入小鼠胸腺细胞，100μl/孔；

   6) 将倍比稀释后的标准品与待测样品加到上述各孔中，100μl/孔，一式3份，设培养液对照及有丝分裂原对照。

   7) 将预先确定的亚适剂量的ConA(终浓度约0.2~2.0μg/ml)或PHA(终浓度为约0.5~4.0μg/ml)加入96孔培养板中，100μl/孔。

   8) 置37℃，5% CO₂培养箱中培养72h，收集*-12h加入³H-TdR 0.5uci/50ul/孔。

   9) 用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上，用β液闪计数仪测定各孔³H-TdR掺入量(cpm值)。

注意事项

1. 所制备的小鼠胸腺细胞存活率应>95%。

2. 标准品及待测样品应以1:2开始至少6个倍比稀释度。

3. 加样时，应以低浓度到高浓度顺序加入，且不可共用加样器头。

4. 由于受其他细胞因子的影响，本法特异性受到一定限制。

5. 亦可用D10G4.1细胞(小鼠T辅助细胞克隆)代替上述小鼠胸腺细胞进行IL-1生物活性检测，基本方法相同。但由于D10G4.1细胞对IL-1的敏感性大大增强，而对IL-2相对不敏感，且对IL-1的敏感性比对IL-2的敏感性大100~1000倍，故本法敏感性与特异性均较小鼠胸腺细胞增殖法。