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小鼠胸腺细胞增殖3H-TdR掺入法检测IL-1的生物活性

时间:2015-06-25 浏览次数:964

实验试剂


1. 75%酒精

2. 5% FCS-RPMI-1640完全培养液与RPMI-1640完全培养液

3. ConA或PHA

4. IL-1标准品:倍比稀释成至少6个不同浓度值。


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实验设备


1. 3H-TdR、β-液闪汁数仪,微量细胞收集仪

2. 解剖刀、剪、单皿、研磨工具(玻璃匀浆器,不诱钢网或者毛玻璃片,用于研磨小鼠胸腺)

3. 96孔细胞培养板

4. 刻度吸管,毛细吸管,刻度离心管、离心机、细胞计数板,倒置显微镜,加样器(头),50%CO2培养箱,超净工作台


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实验材料


1. 小鼠:BALB/C或C57BL/6小鼠,6-10周龄,雌雄均可。

2. IL-1待测样品:倍比稀释成至少6个不同浓度值。


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实验步骤


1. 准备工作与ConA或PHA亚适剂量的确定

测定样品前必须作ConA或PHA的剂量曲线,观察其对小鼠胸腺细胞增殖的影响,选择一个既能够激活胸腺细胞,但又不引起其明显增殖的合适剂量,即亚适剂量。

   1) 在96孔培养板各孔中加入小鼠胸腺细胞,100μl/孔;

   2) 加入不同浓度的ConA(或PHA),100μl/孔,使其终浓度分别为0.5μg/ml,1μg/ml ,2μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,各设三复孔,以不加ConA的培养液作对照;

   3) 置37℃,5% CO2培养箱中培养72h,收获前12h加入3H-TdR,0.5μci/50μl/孔;

   4) 用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上,用β-液闪计数仪测定各孔cpm值;数据(cpm)以三个复孔平均值 标准差表示,

   5) 数据(cpm)以三个复孔平均值 标准差表示,绘制ConA剂量曲线,据此选择亚适剂量,通常为0.2-2.0μg/ml)(终浓度);

2. 操作步骤

   1) 拉颈处死小鼠,浸泡于75%酒精中3-5min,消毒处理;

   2) 无菌操作取出小鼠胸腺,放入含有RPMI-1640完全培养液的平皿中;

   3) 将胸腺剪碎(或研磨工具磨碎),无菌纱布过滤,制成单个胸腺细胞悬液;

   4) 用PRMI-1640完全培养液洗涤上述细胞2次,1500r/min离心10min,然后用5% FCS-RPMI-1640完全培养液调细胞浓度为1.5×107/ml;

   5) 在96孔培养板各孔中加入小鼠胸腺细胞,100μl/孔;

   6) 将倍比稀释后的标准品与待测样品加到上述各孔中,100μl/孔,一式3份,设培养液对照及有丝分裂原对照。

   7) 将预先确定的亚适剂量的ConA(终浓度约0.2~2.0μg/ml)或PHA(终浓度为约0.5~4.0μg/ml)加入96孔培养板中,100μl/孔。

   8) 置37℃,5% CO2培养箱中培养72h,收集*-12h加入3H-TdR 0.5uci/50ul/孔。

   9) 用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上,用β液闪计数仪测定各孔3H-TdR掺入量(cpm值)。


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注意事项


1. 所制备的小鼠胸腺细胞存活率应>95%。

2. 标准品及待测样品应以1:2开始至少6个倍比稀释度。

3. 加样时,应以低浓度到高浓度顺序加入,且不可共用加样器头。

4. 由于受其他细胞因子的影响,本法特异性受到一定限制。

5. 亦可用D10G4.1细胞(小鼠T辅助细胞克隆)代替上述小鼠胸腺细胞进行IL-1生物活性检测,基本方法相同。但由于D10G4.1细胞对IL-1的敏感性大大增强,而对IL-2相对不敏感,且对IL-1的敏感性比对IL-2的敏感性大100~1000倍,故本法敏感性与特异性均较小鼠胸腺细胞增殖法。

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