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大鼠血清、血浆及相关液体样本中胆囊收缩素(CCK)含量的测定

时间:2015-06-25 浏览次数:1007

实验试剂


1. 大鼠胆囊收缩素(CCK)定量检测试剂盒(ELISA)

2. 蒸馏水


锚点

实验设备


1. 37℃恒温箱

2. 标准规格酶标仪

3. 精密移液器及一次性吸头

4. 一次性试管

5. 吸水纸


锚点

实验步骤


1. 准备:从冰箱取出试剂盒,室温复温平衡30分钟。

2. 配液:用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。

3. 加标准品和待测样本:取足够数量的酶标包被板,固定于框架上,分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔,记录各孔位置,在标准品孔中加入标准品50μL;待测样本孔中先加入待测样本10μL,再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍);空白对照孔不加。

4. 温育:37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

5. 洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。

6. 加酶标工作液:每孔加入酶标工作液50μL,空白对照孔不加。

7. 温育:37℃水浴锅或恒温箱温育30min。

8. 洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。

9. 显色:每孔先加入显色剂A 液50μL,再加入显色剂B液 50μL,平板混匀器混匀30s(或用手轻轻震荡混匀30s),37℃避光显色15min。

10. 终止:取出酶标板,每孔加终止液50μL,终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。

11. 测定:以空白孔调零,在终止后15分钟内,用450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。

12. 计算:根据标准品的浓度及对应的OD值,计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样本的OD值,在回归方程上计算出对应的样品浓度,也可以使用各种应用软件来计算。zui终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。


锚点

注意事项


1. 样本不能含叠氮钠(NaN3),因为叠氮钠(NaN3)是辣根过氧化物酶(HRP)的抑制剂。

2. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能立即试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。

3. 样本应充分离心,不得有溶血及颗粒。

4. 实验严格按照说明书的操作进行,实验结果判定必须以酶标仪读数为准。

5. 酶标包被板开封后如未用完,应立即装入密封袋中加干燥剂保存。

6. 建议所有的标准品、样本和空白对照都做双份检测,取平均值,以减小实验误差。

7. 牢记样本已经稀释5倍,计算结果乘以5才是样本实际浓度。

8. 本试剂盒定量范围为20-640ng/L,超过此范围,为标准曲线延伸计算所得,不做为准确定量结果,请用特殊稀释液稀释后测定准确结果(20-640ng/L范围内),乘以总稀释倍数即为样本zui终浓度。

9. 若显色过浅,可适当延长底物温育时间。

10. 为避免交叉污染,标准品、样本和空白对照每加一个就要更换一次吸头;酶标工作液、样本稀释液和底物等公共组分,要悬臂加样,不得碰到微孔;不得重复使用封板膜。

11. 试剂盒保质期内使用,不同批号的试剂不得混用。

12. 底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。

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