实验步骤

一、抗原的提取

　　抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。

　　抗原物质的制备，大概要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。现分别简述如下。

　　（一）材料的选择及预处理

　　选择什么材料主要根据实验目的而定。通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。

　　（二）细胞的粉碎

　　除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。不同的组织，细胞的破碎难易不一，因此所使用的粉碎方法也不*相同。如脑、胰、肝等比较软嫩的组织，用普通匀浆器研磨就行，肌肉、心脏等则需绞碎后再作匀浆。现浆常用的细胞粉碎方法介绍如后。

　　1．物理法

　　（1）高速组织捣碎机：通常由调速器、支架、马达、带杆刀叶、有机玻璃筒等组成。把材料放于筒内（约占筒内容积的1/3）固定筒盖，开动马达，调速器由慢逐渐增至所需速度。此法适用于内脏组织。

　　（2）玻璃匀浆器：由一个内壁经过磨砂的玻璃管和一根一端为球状（球面经过磨砂）玻璃研杆组成。把绞碎的组织置于管内，加适量溶液，插入研杆，用手或电动转动研杆，并上下移动。用此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，对大分子的破坏也少。是粉碎少量软嫩材料（脑、胰、肝等）时常用的方法。

　　（3）超声波处理法：多用于软嫩组织，根据不同组织采用不同频率，处理10～15min，超声波处理时溶液温度升高，使不耐热的物质失活，使用时为防止温度升高，除间歇开机外，还需人工降温，避免溶液内存在气泡。核酸及某些酶对超声波很敏感，要慎用。

　　（4）反复冻融法：把待碎样品冷却到零下15～20。C，冻固后取出，缓慢解冻，如此反复操作，可使大部分动物性细胞及胞内的颗粒破碎，但也可使生物活性物质失活。

　　（5）冷热交替法：把材料投入90。C左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内，可使大部分细胞破碎。可用于提取蛋白质和核酸。

　　2．化学和生物化学法

　　（1）自溶法：把新鲜材料置于一定的pH和适宜的温度下，利用组织细胞自身的酶系统把组织破坏，使细胞内容物释放出来。动物材料的自溶温度选在0～4℃，需加少量防腐剂，自溶时间较长，不易控制，不常用。

　　（2）溶菌酶处理法：多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100μg至1mg溶菌酶，37℃，保温10min，细胞就破坏了。此外，蜗牛酶、纤维素酶也被选作破碎细菌细胞之用。

　　（3）表面活性剂处理法：较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。

　　（三）抗原的提取

　　提取、抽提、萃取这3个词的含义基本相同。但一般说来，提取是指在分离纯化前期，将经过处理或粉碎了的细胞置于一定条件和溶剂中，让被提取物充分地释放出来的过程，而抽提则是贯穿于分离纯化的整个过程中，如在制备核酸过程中，用氯仿反复提取蛋白液，用苯酚反复抽提分离DNA和RNA。影响提取的因素主要来自被提取物在提取的溶剂中的溶解度大小以及它由固相扩散到液相的难易。一个物质在某一溶剂中的溶解度大小和该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质有关。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性大分子的等电点远的pH值使溶解度增加。因此，在不同的抗原提取过程中，所选用的溶剂的性质、pH值、离子强度、抽提温度、介电常数等因素是提取成败的重要因素。要达到分离提纯的目的，必须灵活地应用这些因素。