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烟草转化实验流程

时间:2015-07-08 浏览次数:1031

 

实验材料

烟草细胞:BY-2

锚点

实验步骤


1. BY-2 细胞培养

BY -2 细胞悬浮培养在摇床上,避光,温度260 C,转速130r pm,每7天将 1m l 细胞转入20m l新鲜的液体培养基中继续培养。BY -2 伤组织生长在固体培养基上,每3-4周继代一次。转的悬浮细胞和愈伤组织生长在含相应抗生素的培养基中。

2. 用干转化的农杆菌GV3101的准备

(1)接种农杆菌单菌落到2 ml新鲜的YEB液体培养基中,28“;

(2)200ul培养物加到l0ml新的培养基中继续培养3-4小时:

(3) '5000 rpm,离心5 min集菌,用BY-2液体培养基重悬菌体,OD0.5左右,待用。

3. 农杆蔺介导的BY-2悬浮细胞的外源基因转化

(1)取生长到第34天的BY-2细胞4 ml,加入上述备用的农杆菌液100ul,共培 3;

(2) 500 g离心2 min,收获细胞并用BY-2液体培养基(Amp 500 mg/L)3 :

(3)将细胞稀释后铺于BY-2固体培养基的平板(Kan 100 mg/L, Amp 500mg /L )上,26黑暗培养。

(4)四周后,取出生长良好的愈伤小块,打散后放入液体培养基悬浮培养。

4. 农杆菌介导的BY-2愈伤组织的外源基因转化

(1)取培养2-3周的烟草愈伤组织小块浸入农杆菌液中20 min,取出用无菌滤纸干,置BY-2 培养基平板(无抗生素)上培养2;

(2)取出愈伤小块,用无菌水洗4次,然后用含抗生素(Amp 500 mg/L)的无浸泡30-60m in;

(3)取出愈伤小块,用无菌滤纸吸干,置于培养BY-2的平板(Amp500mg/LKan100mg/)上。

(4)培养四周后,挑出生长的愈伤小块,转移到新的抗性平板(Kan 100 mg/L)

生长;

(5)取出生长良好的愈伤小块,打散后放入液体培养基中,26'C, 130 rpm,上黑暗培养;

(6)7天继代一次。

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