实验原理

干抗素是干扰素诱生剂作用于有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能蛋白质。它从细胞产生和释放出来以后，又作用于相应的其它同种细胞，使其获得抗病毒及抗肿瘤等多方面的免疫力。

所谓干扰素诱生剂，是指能诱导有关生物细胞产生干扰素的一类物质。能诱导有关生物细胞产生α和β干扰素者称甲类干扰素诱生剂，如各种动物病毒、细胞内寄生的微生物等；可诱导T细胞产生γ干扰素的称为乙类干扰素诱生剂，如脂多糖、链球菌毒素、肠毒素A等。

在实际工作中，制备干扰素多采用两种方法。一是用干扰素诱生剂诱导某些生物细胞产生干扰素，经提取纯化并检定合格后即可使用。该法所用的细胞多为外周血白细胞。二是采用基因工程法进行生产，即将干扰素基因导入大肠杆菌内，通过培养大肠杆菌来生产干扰素。目前，大规模生产干扰素主要采用基因工程法。

实验设备

细胞培养设备(如培养瓶、多孔培养板、温箱、显微镜、旋转培养器等)、水浴箱等。

实验步骤

1. 制备诱生剂：采用NDVF系弱毒株，以鸡胚尿囊液形式保存于-20℃，

其血凝滴度稳定在1:640～1:1 280之间。大量繁殖时，用0.5%水解乳蛋白稀释100～1 000倍，接种于9日龄鸡胚尿囊腔，置37℃培养72h后，收获尿囊液，效价测定应大于1:640，无菌检查应合格。

2. 制备诱生细胞：无菌采取人外周血(多用人脐带血，或血库贮藏血)，置于含肝素的无菌瓶内，于4℃保存不超过24h，诱生细胞(白细胞)不单独提取，以全血代替。

3. 制备粗制干扰素：

   1) 加诱生剂，按1ml抗凝全血加0.2ml诱生剂(即NDVF系尿囊液，其血凝滴度不低于1:640)；

   2) 加温吸附，将加有诱生剂的抗凝全血置37℃水浴中1h，每隔15min晃动一次，使NDVF吸附于白细胞上。然后以1000r/min离心20min，弃上清，留沉淀物；

   3) 加营养液孵育诱生，按抗凝全血的1～2倍量加Eagle营养液于上述沉淀物中，混匀，置35～36℃温箱内旋转培养18～20h；

   4) 离心及酸处理，将上述培养物以2000r/min离心30min，取上清，以6mol/L盐酸将其pH值调至2.0，置4℃冰箱5天灭活NDV；

   5) 中性化，经5天酸化后，再用6mol/L氢氧化钠将pH值调至7.2～7.4，即为粗制干扰素。

4. 制备精品干扰素：

   1) KCNS沉淀，取上述粗制干扰素，加KCNS并用2mol/L HCl调pH值为3.5，然后以2 000r/min离心30min取沉淀；

   2) 酒精提取，将沉淀溶于95%酒精(预冷至-20℃)，用2mol/L NaOH调pH值为4.2，以2 000r/min离心30min取上清；用2mol/L HCl调pH值至3.5，离心后取上清，再将pH值调至5.6，离心后取上清，zui后将pH值调至7.1，离心后取沉淀；

   3) 过碘酸钠沉淀，将沉淀溶于PBS中，加过碘酸钠，并调pH值为4.5，用50%乙醇10倍稀释，离心后取上清，将上清液对0.3mol/L (NH₄)₂CO₃(pH值7.6)在4℃下透析过。

   4) sephacryl S200柱层析：将sephacryl S200按要求处理后装柱(4～5×100cm柱)，用PBS平衡后，加样(即上述上清液)，用洗液洗脱。洗脱期间用核酸蛋白仪连续检测，收集相应峰即为精制干扰素。取样进行效价测定，按结果进行稀释，分装并冻干。

5. 检定

   1) 效价测定

      a. 制备攻击病毒：将水泡性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维母细胞上传代后，

再在猪细胞(IBRS)上传3～5代，使其对IBRS有良好致病效应，其TCID50应稳定(一般在10^-6～10^-7之间)。

      b. 准备测定细胞：生长良好的幼龄IBRS单层细胞。

      c. 测定：取上述单层细胞分为若干组，每组加不同稀释度的干扰素，置37℃孵育20～24h，然后每管均用100个TCID50的VSV攻击，置37℃ 48～72h孵育后，观察结果。同时设细胞对照组和病毒对照组。病毒对照组CPE＞75%，正常细胞对照组CPE=0，即认为该测定系统有效。干扰素判定标准是以能保护半数细胞免受攻击病毒损害的干扰素zui高稀释度的倒数作为干扰素的单位。

   2) 酸碱度测定

取本品10支，加水溶解，精密测量pH值应为6.0～7.5。

   3) 水分测定

按磺硫溶液法测定，不得超过3%。

   4) 安全试验

取本品加水溶解，小鼠尾静脉注射，48h内不得有死亡。

   5) 热原检查

取本品1支，加水溶解，依法检查，应符合规定。

   6) 菌检

取本品3支，无菌水溶解，分别接种到检查需氧菌、厌氧菌及霉菌用培养基上，37℃培养1周，应无菌生长。

   7) 超敏反应

取健康豚鼠6只，每只腹腔注射本品适量，连续3次，于20天后再于耳静泳注入本品适量，应无过敏反应现象发生。

注意事项

1. 制备NDVF系弱毒诱生剂时，种毒应无菌检查合格，且滴度在1:640以上。收毒时，应将污染的鸡胚弃去。

2. 不必从血液中将白细胞提取出来，因红细胞对白细胞产生干扰素有营养作用。纯化的白细胞产生干扰素效价不一定高。

3. 酸化的目的是杀死其中的诱生剂NDV，而在pH值20时，干扰素是稳定的。

4. 在常温下干扰素半衰期很短。故各种操作要在低温环境下进行，动作要迅速，纯化所用试剂要作预冷处理。干扰素粗品及精品要及时置低温下存放。效价测定时，干扰素应于临用时现溶解。