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干扰素的制备及检测实验

时间:2015-07-08 浏览次数:932

实验原理


干抗素是干扰素诱生剂作用于有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能蛋白质。它从细胞产生和释放出来以后,又作用于相应的其它同种细胞,使其获得抗病毒及抗肿瘤等多方面的免疫力。

所谓干扰素诱生剂,是指能诱导有关生物细胞产生干扰素的一类物质。能诱导有关生物细胞产生α和β干扰素者称甲类干扰素诱生剂,如各种动物病毒、细胞内寄生的微生物等;可诱导T细胞产生γ干扰素的称为乙类干扰素诱生剂,如脂多糖、链球菌毒素、肠毒素A等。

在实际工作中,制备干扰素多采用两种方法。一是用干扰素诱生剂诱导某些生物细胞产生干扰素,经提取纯化并检定合格后即可使用。该法所用的细胞多为外周血白细胞。二是采用基因工程法进行生产,即将干扰素基因导入大肠杆菌内,通过培养大肠杆菌来生产干扰素。目前,大规模生产干扰素主要采用基因工程法。


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实验设备


细胞培养设备(如培养瓶、多孔培养板、温箱、显微镜、旋转培养器等)、水浴箱等。


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实验步骤


1. 制备诱生剂:采用NDVF系弱毒株,以鸡胚尿囊液形式保存于-20℃,

其血凝滴度稳定在1:640~1:1 280之间。大量繁殖时,用0.5%水解乳蛋白稀释100~1 000倍,接种于9日龄鸡胚尿囊腔,置37℃培养72h后,收获尿囊液,效价测定应大于1:640,无菌检查应合格。

2. 制备诱生细胞:无菌采取人外周血(多用人脐带血,或血库贮藏血),置于含肝素的无菌瓶内,于4℃保存不超过24h,诱生细胞(白细胞)不单独提取,以全血代替。

3. 制备粗制干扰素:

   1) 加诱生剂,按1ml抗凝全血加0.2ml诱生剂(即NDVF系尿囊液,其血凝滴度不低于1:640);

   2) 加温吸附,将加有诱生剂的抗凝全血置37℃水浴中1h,每隔15min晃动一次,使NDVF吸附于白细胞上。然后以1000r/min离心20min,弃上清,留沉淀物;

   3) 加营养液孵育诱生,按抗凝全血的1~2倍量加Eagle营养液于上述沉淀物中,混匀,置35~36℃温箱内旋转培养18~20h;

   4) 离心及酸处理,将上述培养物以2000r/min离心30min,取上清,以6mol/L盐酸将其pH值调至2.0,置4℃冰箱5天灭活NDV;

   5) 中性化,经5天酸化后,再用6mol/L氢氧化钠将pH值调至7.2~7.4,即为粗制干扰素。

4. 制备精品干扰素:

   1) KCNS沉淀,取上述粗制干扰素,加KCNS并用2mol/L HCl调pH值为3.5,然后以2 000r/min离心30min取沉淀;

   2) 酒精提取,将沉淀溶于95%酒精(预冷至-20℃),用2mol/L NaOH调pH值为4.2,以2 000r/min离心30min取上清;用2mol/L HCl调pH值至3.5,离心后取上清,再将pH值调至5.6,离心后取上清,zui后将pH值调至7.1,离心后取沉淀;

   3) 过碘酸钠沉淀,将沉淀溶于PBS中,加过碘酸钠,并调pH值为4.5,用50%乙醇10倍稀释,离心后取上清,将上清液对0.3mol/L (NH4)2CO3(pH值7.6)在4℃下透析过。

   4) sephacryl S200柱层析:将sephacryl S200按要求处理后装柱(4~5×100cm柱),用PBS平衡后,加样(即上述上清液),用洗液洗脱。洗脱期间用核酸蛋白仪连续检测,收集相应峰即为精制干扰素。取样进行效价测定,按结果进行稀释,分装并冻干。

5. 检定

   1) 效价测定

      a. 制备攻击病毒:将水泡性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维母细胞上传代后,

再在猪细胞(IBRS)上传3~5代,使其对IBRS有良好致病效应,其TCID50应稳定(一般在10-6~10-7之间)。

      b. 准备测定细胞:生长良好的幼龄IBRS单层细胞。

      c. 测定:取上述单层细胞分为若干组,每组加不同稀释度的干扰素,置37℃孵育20~24h,然后每管均用100个TCID50的VSV攻击,置37℃ 48~72h孵育后,观察结果。同时设细胞对照组和病毒对照组。病毒对照组CPE>75%,正常细胞对照组CPE=0,即认为该测定系统有效。干扰素判定标准是以能保护半数细胞免受攻击病毒损害的干扰素zui高稀释度的倒数作为干扰素的单位。

   2) 酸碱度测定

取本品10支,加水溶解,精密测量pH值应为6.0~7.5。

   3) 水分测定

按磺硫溶液法测定,不得超过3%。

   4) 安全试验

取本品加水溶解,小鼠尾静脉注射,48h内不得有死亡。

   5) 热原检查

取本品1支,加水溶解,依法检查,应符合规定。

   6) 菌检

取本品3支,无菌水溶解,分别接种到检查需氧菌、厌氧菌及霉菌用培养基上,37℃培养1周,应无菌生长。

   7) 超敏反应

取健康豚鼠6只,每只腹腔注射本品适量,连续3次,于20天后再于耳静泳注入本品适量,应无过敏反应现象发生。


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注意事项


1. 制备NDVF系弱毒诱生剂时,种毒应无菌检查合格,且滴度在1:640以上。收毒时,应将污染的鸡胚弃去。

2. 不必从血液中将白细胞提取出来,因红细胞对白细胞产生干扰素有营养作用。纯化的白细胞产生干扰素效价不一定高。

3. 酸化的目的是杀死其中的诱生剂NDV,而在pH值20时,干扰素是稳定的。

4. 在常温下干扰素半衰期很短。故各种操作要在低温环境下进行,动作要迅速,纯化所用试剂要作预冷处理。干扰素粗品及精品要及时置低温下存放。效价测定时,干扰素应于临用时现溶解。

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