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小鼠角质细胞的分离和培养

时间:2015-08-05 浏览次数:1060

实验试剂



HBSS: 
NaCl 8g/L
KCl 400mg/L
KH2PO4 60mg/L
无水Na2PO4 47.86mg/L
无水葡萄糖 1000mg/L
NaHCO3 350mg/L


锚点

实验材料


妊娠期BALB/c小鼠


锚点

实验步骤


1. 将1~2天龄新生裸鼠窒息后,置于培养皿中,用1%碘聚乙烯吡咯烷酮液洗净裸鼠,流水彻底冲洗,然后用70%乙醇洗两次。小鼠应立即使用,若待处理的小鼠数量较多,可置冰上30min。
2. 去除小鼠的四肢和尾巴。
3. 将小鼠从尾巴至鼻子的皮肤作一简单切口,用大鼠牙齿镊轻轻将整个身体的皮肤剥下,用一把镊子夹住身体,另一把镊子拉开皮肤。
4. 将剥下的皮肤组织置于放在冰上的无菌培养皿表面,直至所有的皮肤收集完毕。
5. 用2把大鼠牙齿钳夹住皮肤组织,在含2.5%胰蛋白酶的HBSS无菌培养皿中漂洗皮肤组织(组织在下),然后置4oC过。表皮不应淹没在胰蛋白酶液中。
6. 从胰蛋白酶处理液中取出组织,将表皮面朝下置于干燥的无菌细胞培养皿表面。表皮易于贴附于塑料上,组织用组织钳扯去,鼠龄与此有影响,天龄越大,去其表皮越困难。
7. 用剪刀小心地将表皮残留物剪碎,置于含“常规"培养液(MEM含10%FCS,100IU/ml青霉素,100ug/ml链霉素,2~4mmol/L L-谷氨酰胺;每5只小鼠皮肤用10ml)的无菌烧瓶中,磁力搅拌器37oC剧烈搅拌45min。
8. 用4层无菌Nitex纱布(16um孔,Martin提供)过滤液体。当其他细胞通过时角质层细胞留在纱布的表面。
9. 用培养瓶将细胞洗下,培养基的用量约为一块皮肤10ml,将细胞接种于塑料细胞培养瓶中或玻璃盖玻片上,37oC培养4~12h。
10. 4~12h后观察培养皿表面的细胞群。
11. 将细胞转移至低钙培养液,角质细胞将开始繁殖。这种转移防止细胞的分层。低钙液由MEM(无钙)和10%螯合的FCS(同样含有正常水平的青霉素、链霉素)组成。螯合的血清按下法准备:每50ml血清需20g树脂,Chelex 100(Bio-Rad)。将树脂置于水中,40g/L,pH约为7.4,放置滤纸于漏斗上,过滤树脂。加入树脂于FCS中,搅拌60min。接着过滤使血清变得清亮,再用0.45ug滤纸除菌。后者过滤过程较慢。需用购买的商品化滤器。完全培养液中钙离子浓度约为0.09mmol/L,与0.15mmol/L钙浓度相比这是普通培养液。


锚点

注意事项


小鼠角质细胞在低钙中维持至1周时间,尽管细胞活力有所降低。可通过商业途径如Clonetics和GIBCO/BRL获得书中低钙、无血清培养液培养角质细胞。胶质细胞在这种培养液中能保存较长时间,并在多数情况下进行几次分裂。为了诱导角质细胞分层,应向细胞中加入正常水平的钙。
使用一次性塑料组织培养器材,而不是玻璃器材。若确需使用玻璃器材,应用酸浸泡后再行高压灭菌。需要使用的器材还有大叔牙齿钳、尖解剖剪、活组织吸取器。上述器材应高压灭菌或在95%乙醇中浸泡、烧灼。

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