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IEF分离蛋白质

时间:2015-12-04 浏览次数:1468

实验试剂

 

样品提取液(8M尿素、2%非离子型去污剂NP-40、2%Ampholin,pH3.5-10、2%DTT)

胶母液 (30%的29/1的Acr/Bis),两性电解质

阳极缓冲液 1M磷酸

阴极缓冲液 1M氢氧化钠

固定液(10%的三氯、1%的磺基水杨酸)

染色液(35%乙醇、10%冰醋酸、0.15%考马氏亮蓝R250)

脱色液(35%乙醇、10%冰醋酸)

 

实验设备

 

高压电泳仪、IEF槽、离心机等

 

实验步骤

 

1. 样品提取

   1) 1ml原核表达细胞液离心取沉淀

   2) 沉淀用100ulIEF样品缓冲液裂解,离心取上清

2. 制胶

   1) 安装超薄胶装置

   2) 依次加入下述试剂

            胶母液             2ml

            尿素               8M    /脱气

            NP-40            0.2ml

            两性电解质         2ml

            10%过硫酸胺       50ul

            TEMED             5ul

   3) 倒胶

3. 电泳

   1) 预电泳胶凝固后,拆卸制胶装置,将胶连同支持膜一起置于水平电泳槽上(要求,电泳槽面板上首先被液体石蜡浸润,在凝胶支持膜与电泳槽面板间无气泡)。

   2) 将分别被阴阳极缓冲液浸润的电极条置于胶面上将与阴阳电极接触的部位,盖上电泳槽罩子,连通电源,200V预电泳10min。

   3) 电泳,将薄棉纸剪成小块,轻轻置于预备点样的胶面上,取10-15ul样品液,点于薄棉纸上,盖上罩子,连通电源进行电泳

   4) 电泳参数

    200V 30min,400V 30min,800V4hr

4. 染色

   1) 固定,将电泳完的胶连同支持膜放置于固定液中,10min.

   2) 显色,50℃下,将胶与支持膜放置于染色液中,显色,直至条带出现。

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