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酸性磷酸酶的显示方法

时间:2016-05-25 浏览次数:1791

实验试剂

 

1.   10%中性福尔马林(pH6.8~7.1)甲醛 10ml 蒸馏水 90ml 醋酸钠 2g

2.   酸性磷酸酶作用液

  蒸馏水 90ml 0.2mol/L醋酸缓冲液(pH4.6) 12ml 5%硝酸铅 2ml

3.   2%β—甘油磷酸钠 4ml

  先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合,随后分成大致相等的两份,一份中加硝酸铅溶液,另一份加甘油磷酸钠溶液,然后再将两者缓缓混合,边混边搅匀后若酸碱度值不到pH5.0,可加少量醋酸的调整。此作用液在临用前配制,不能贮存。配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀,否则将严重影响实验结果。

4.   1%硫化胺溶液

  硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml

5.   姬姆萨染液(1:30)

  姬姆萨原液 3滴 磷酸盐缓冲液(pH6.8) 5ml

6.   6%淀粉肉汤

  牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1.0g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100ml

  高压灭菌9.9×104pa(15磅)20min,再加入可溶性淀粉6g,水温浴,促使溶解后置冰箱保存备用。

 

实验步骤

 

1.   取小白鼠一只,每日腹腔注射6%淀粉肉汤1ml,连续注射三天。

2.   在第三天注射后3~4h,再向腹腔注射生盐水1ml,过3min后在原注射部位抽取腹腔液0.1~0.2ml。请注意!注射和抽液的进针部位和深度要保持一致。否则可能抽不出腹腔液。

3.   将腹腔液滴在预冷的载玻片上,每片1~2滴,涂片,将玻片垂直插入玻片架,迅速放到冰箱内(4℃),让细胞自行铺展。

4.   30min后,将玻片转入10%中性福尔马林,冰箱内4℃固定30min。

5.   自来水漂洗5min,把水甩干。

6.   转入酸性磷酸酶作用液中,37℃处理30min。

7.   自来水漂洗片刻。

8.   1%硫化胺处理3~5min。

9.   自来水冲洗,甩干。

10.用1∶30的姬姆萨染液染色15min。

11.自来水冲去染液,用磷酸盐缓冲液临时封片,镜检。

12.对照实验:

将第3步的腹腔液涂片置50℃温箱中处理30min,使酶失活,再进行6~11步的同样实验。

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