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禽流感病毒检测技术的研究新进展

更新时间：2013-04-04 浏览次数：1259

禽流感（ＡＩ）是由Ａ型流感病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）的感染和／或疾病综合症。禽流感病毒属正黏病毒科流感病毒属，典型病毒粒子为球形，直径８０～１２０ｎｍ，有时呈丝状体等形态。至今已发现Ａ型流感病毒的血凝素（ＨＡ）有１６种，神经氨酸酶（ＮＡ）有９种（傅生芳，２００５），根据表面糖蛋白ＨＡ和ＮＡ的抗原性差异可以分为１６个ＨＡ亚型和９个ＮＡ亚型，不同亚型病毒之间可以通过交换某些基因片段发生基因重排，出现具有新的生物学特征的病毒，因此，ＡＩＶ zui显著的生物学特征之一就是亚型众多。而且，不同亚型或血清型之间无交叉反应性或反应性低，这使得禽流感的诊断监测工作较为困难。禽流感根据ＡＩＶ致病力的强弱可分为高致病性（ＨＰＡＩＶ）和低致病性（ＬＰＡＩＶ），前者不仅可以引起家禽死亡，还可以造成人的感染死亡，因此，控制ＡＩＶ的发生和流行具有重要意义。文章就禽流感近几年的研究，尤其是在病原学检测、免疫分
析方法和分子生物学检测方法的研究进行了综述。
 
１　病原学检测
１．１　病毒的分离鉴定
ＡＩＶ 在鸡胚中生长良好，将疑似病料经适当处理接种在９～１０日龄的鸡胚中，分离培养病毒。若检测出有凝血活性，可进一步确定分型；若无凝血活性，则认为未分离到病毒（赵翠燕等，２００３），该方法具有、敏感的优点，但操作繁琐，耗时较长，需要１周左右的时间。
 
１．２　电镜技术　
利用电镜技术可以直观准确地鉴别病毒，根据病毒自身的形态、结构等不同特征，能很快做出诊断。检验结果与样品制备技术、收取病料的部位和时间有关，电镜法不能用于亚型及致病性的测定且其受到设备的限制，投入资金较大（刘志杰等，２０１１）

２　免疫分析技术
２．１　免疫传感技术　
随着生物传感器的飞速发展，出现了生物传感器微阵列、微系统，该技术灵敏度高、响应快，不需要标记，既可定性又可定量，克服了传统检测方法费时、昂贵、标记及操作繁琐等缺点，具有极广泛的发展前景及临床使用价值，成为生物传感器领域的研究热点（姚春艳等，２００６）。免疫识别膜的固定化技术是生物传感器制作的核心部分，其固定化技术决定着生物传感器的选择性、灵敏度、稳定性和寿命等主要性能，也决定着生物传感器是否有研究和应用价值。詹爱军等（２００９）将石英晶片谐振的高灵敏度与免疫反应的特异性相结合，用蛋白Ａ（ＳＰＡ）在镀金膜的石英晶体电极偶联抗Ｈ９亚型流感病毒的单抗构建传感器探头形成免疫传感器。检测结果表明，该方法具有较好的特异性，不与Ｈ５亚型禽流感病毒和新城疫病毒（ＮＤＶ）反应，检测灵敏度达到２０ＥＩＤ５０，组成的检测器对相应的流感病毒响应良好，该法与鸡胚病毒分离法检出流感病毒的符合率达到９１％。林向华等（２００９）以ＡＴ切型、基频１０ＭＨｚ的石英晶体为材料，设计四通道芯片微阵列。采用聚乙烯亚胺黏附—戊二醛交联法
将禽流感Ｈ５、Ｈ９亚型单克隆抗体固定在石英晶体的金膜电极表面制备生物敏感膜，构建可用于同步检测禽流感Ｈ５、Ｈ９亚型的压电免疫芯片。构建的压电免疫芯片用于检测Ｈ５、Ｈ９亚型抗原和疑似样品，其各自的响应值与空白对照的噪声值之比均大于２，试验构建的压电免疫芯片可用于禽流感Ｈ５、Ｈ９亚型的定性检测。
 
２．２　蛋白质芯片技术　
蛋白质芯片技术是一种高通量、高灵敏度、自动化的蛋白质分析技术，在蛋白质组的功能研究、疾病诊断及药物开发中显示出巨
大的应用潜力（Ｓａｎｇ等，２００８）。石霖等（２００９）制备了可以同时鉴别诊断禽流感（ＡＩ）、新城疫（ＮＤ）２种
禽病血清抗体的可视化蛋白质芯片，将芯片与待检血清杂交后，再与胶体金标记的二抗杂交，银染显色后根据灰度值判定结果，该可视化蛋白质芯片具有很好的特异性，?Z?X暅 并且检测灵敏度是琼脂糖凝胶扩散（ＡＧＰ）方法的４００倍以上。研究结果表明，该方法可用于同步鉴别两种禽病，是一种有效的抗体检测新方法。该技术不仅保留了抗原—抗体反应快速、灵敏和特异性的特点，还可以满足生物样本多指标分析的需要，因此更利于大规模推广应用（Ｓｍｉｔｈ等，２００６）。
 
２．３　胶体金免疫层析法　
陈洪等（２００７）用胶体金颗粒标记Ｈ５ 亚型禽流感病毒单克隆抗体Ａ（Ｂ５Ｃ７），用羊抗鼠ＩｇＧ和Ｈ５亚型禽流感病毒单克隆抗体Ｂ（３Ｃ４）喷涂于硝酸纤维膜质控线和检测线上，研制出Ｈ５亚型禽流感病毒抗原金标快速诊断试纸条。用禽流感Ｈ
５、Ｈ９标准抗原和新城疫标准抗原作为检测抗原对研制的试纸条进行特异性、敏感性和稳定性试验，试验结果表明该方法操作简单、灵敏度高、特异性强、稳定性好，具有良好的应用前景。单抗介导的斑点免疫金渗滤法（ＤＩＧＦＡ）是利用Ａ型禽流感单克隆抗体和胶体金标记技术建立的快速检测ＡＩＶ方法。敏感性高于ＨＡ诊断方法，２０～３０ｍｉｎ即可出结果，ＤＩＧＦＡ 具有不需试验设备、可用肉眼判定、方法简便、试剂用量少、对人体无害等优点（雷彩侠，２００７）。

２．４　荧光抗体试验
免疫荧光技术（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ，ＩＦＡ）是利用被标记上荧光色素的抗原（或抗体）特异性地与抗体（或抗原）结合，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应来进行观察的检测方法。zui早用于鉴定ＡＩＶ 的ＮＰ和ＭＰ抗原，１９６１年开始用于人类流感的快速诊断。秦爱建等（２００３）研制了抗禽流感Ｈ５和Ｈ９亚型病毒的单克隆抗体，建立了免疫荧光方法检测ＡＩＶ，可以检测出相应的Ｈ５亚型病毒。建立在单克隆抗体基础上的免疫荧光方法具有快速、简便、易行、较敏感等特点，也常用于临床诊断，但出现假阳性的几率较高。

 

２．８　乳胶凝集试验
乳胶凝集试验（ＬＡＴ）主要用来检测ＩｇＭ 抗体，其特点敏感性不如经典的ＨＩ试验，但由于不需要较高的试验技术和特定的仪器设备，简单、快速，可方便地用于临床诊断和生产实践。喻正军等（２００５）以羧化的聚苯乙烯乳胶为载体，采用了共价偶联的技术，经双功能试剂将ＡＩＶ的ＨＡ抗原表达产物和羧基化的乳胶共价偶联起来，对血清中特异性ＨＡ抗体进行检测，克服了蛋白质致敏普通乳胶时，致敏抗原量少、不稳定，致敏抗原上的蛋白质容易脱落等缺点。此外，血凝及血凝抑制试验（ＨＡ，ＨＩ）简单、快速、特异性好，但敏感性较差，主要用于ＡＩＶ 亚型鉴定和病毒分离鉴定的辅助手段，不能直接检测组织液和分泌液中的病毒，并且需要排除新城疫病毒、腺病毒等的干扰，且不能检出病毒新的ＨＡ亚型。神经氨酸酶抑制试验（ＮＩＴ）主要用于ＡＩＶ 的表面抗原神经氨酸酶的亚型鉴定，虽不能提供常量法的定量，但却是Ａ型流感病毒的分类和抗体检测的快捷方法，被世界卫生组织推荐用于ＮＡ 亚型的分类（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，２００８fs19 ）。ＮＩＴ成本较低且有可重复性，但试验繁琐，不易掌握，易受病毒ＨＡ抗体的干扰（任丽伟等，２００９）。病毒中和试验（ＮＴ）是zui敏感且特异的血清学方法，检出率也相当高，虽然它的操作繁琐且耗时，但它高度的特异性是*的，很多新的检测方法都要以之为标准来进行比较（杨帆，２００７）。
 
布在很小的载玻片等载体上，通过与标记的样品进行杂交，检测杂交信号的强弱进而判断样品中被检分子的数量。曹三杰等（２００６）制备的ＮＤＶ－ＩＢＶＡＩＶ－ＩＢＤＶ诊断基因芯片质量好，可对ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＡＩＶ和ＩＢＤＶ 进行诊断检测，具有检测灵敏性好，特异性高和芯片可重复检测的优点。试验对３０个临床样品进行初步应用检测，结果表明该诊断基因芯片技术与ＲＴ－ＰＣＲ检测技术检出率基本一致，并具有同步诊断检测多种疫病的优点。Ｘｕｅ等（２００８）通过设计ＡＩＶ　２５个特异性引物和１个通用引物，经ＲＴ－ＰＣＲ 或重叠ＰＣＲ 扩增了这２５ 个亚型的ｃＤＮＡ，研制出了一种能检测禽流感１６个ＨＡ和９个ＮＡ的ＤＮＡ芯片。由于基因芯片技术特异、敏感且允许同时扫描成百上千的核苷酸序列，已成为一种具有巨大潜能的禽流感诊断方法。上已经有关于基因芯片技术在流感亚型鉴别上应用的报道，直接检测流感病毒的ｃＤＮＡ技术将作为流感病
３．４　核酸依赖的扩增　
核酸依赖的扩增（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＮＡＳＢＡ）是一种连续、等温、基于恒温反应的核酸扩增技术。该技术使用３种（禽类成肌细胞增多症病毒反转录、核糖核酸Ｈ、噬菌体Ｔ７核糖核酸聚合酶）和２种特别设计的寡核酸引物。上游引物５′末端包含有噬菌体Ｔ７的依赖于ＤＮＡ的ＲＮＡ聚合的启动子序列，下游引物的５′末端包含有和钌标电化学发光检测探针（ＥＣＬ　Ｐｒｏｂｅ）互补的序列。在扩增步骤中，两个５′端都整合进扩增序列中，从而率生产出互补ＲＮＡ序列的模板。该技术特点是整个扩增过程在恒温条件下进行，不受背景中ＤＮＡ的干扰，不易发生交叉污染，扩增效率高于ＰＣＲ，特异性好，不需要特殊（如ＰＣＲ仪）的控温装置，检测禽流感群特异性毒株（Ｈ１、Ｈ１５）（ＮＡＳＢＡ－ＡＩＶ）、Ｈ５亚型（ＮＡＳＢＡＨ５）、Ｈ７亚型（ＮＡＳＢＡ－Ｈ７）的ＮＡＳＢＡ／ＥＣＬ检测
件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。谢青梅等（２０１０）根据ＨＡ 基因保守区的序列，设计４条特异性引物进行核酸扩增，扩增后产物加入核酸染色剂ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ和４ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋，结果可视。扩增产物可用特异性内切酶ＫｐｎⅠ进行酶切鉴定。用已建立的ＲＴ－ＬＡＭＰ技术检测临床样品，检测结果与ＲＴ－ＰＣＲ 方法一致。ＲＴＬＡＭＰ技术整个检测过程只需１～２ｈ，不需要ＰＣＲ仪和成像系统，仅需要恒温水浴锅即可完成试验。通过特异性、敏感性试验，验证了建立的ＲＴ－ＬＡＭＰ技术可以作为一种操作简单，灵敏性、特异性高的检测Ｈ５亚型禽流感病毒的方法。
 
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