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DNA专题:真核细胞基因组提取

时间:2013-07-27 浏览次数:958

一. 实验目的及背景
       高等动物,高等植物的基因组相当庞大, 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成,果蝇基因组有1.4×108个碱基对,水稻基因组有1.4×109个碱基对。真核细胞基因组中,约1万-1.5万个可表达的结构基因,其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组,包含了该物种生长,发育,繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量,因而对真核细胞基因组的结构,组成,以及表达调控的研究是至关重要的,而研究的起点就是要获得纯度高--不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染;得率好--以便有足够量用于分析;基因组相对完整--断裂的基因组以便用于以后PCR分析,RFLP分析,基因文库的构建,基因探测等的研究。
      真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步,首先是机械法破细胞抽提;然后去除蛋白质,糖类等细胞内杂质污染;zui后纯化出DNA,由于真核细胞基因组较大,在操作中应注意动作轻柔,且在低温下进行,以zui大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切,从而获得相对完整的DNA。

      二.实验试剂及材料
      材料:幼嫩的植物材料0.5g左右。
      试剂:液氮
      CTAB抽提缓冲液:2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基*基溴化铵),1%β-巯基乙醇 1.4mol/L Nacl,20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris-Hcl pH8.0
      3M NaAC
      50mM Tris-HCl pH8.0
      20mM EDTA
      氯仿:异戊醇(24:1)
      异丙醇 70%乙醇TE buffer


三.实验方法
      1.取0.5g植物材料,双蒸水洗净,并用滤纸吸干。
      2.植物材料剪成1cm左右碎片,放入预冷的瓷研钵中。
      3.加入液氮速冷,研磨成细粉(越细越好)。
      4.在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5ml,60℃保温1小时。
      5. 15000rpm,离心10分钟。上清转入另一个新的离心管中。
      6.加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),混匀抽提至水乳胶融状。
      7. 15000rpm,离心10分钟。
      8.上清转入另一个新的离心管中。
      9.加入2/3倍体积预冷异丙醇,-20℃保温30min―1hr,缓缓混匀DNA成絮状折出。
      10.15000rpm,离心10分钟,弃上清。
      11.DNA沉淀用 70%乙醇洗2次。
      12.加入400μl TE buffer溶解DNA。
 

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