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DNA专题:质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测

时间:2013-07-27 浏览次数:1171

一、碱变性法提取质粒DNA

质粒(Plasmid)是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。带有遗传信息,可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。

分离和纯化质粒DNA的方法很多,但这些方法基本包括三个步骤:即细菌的培养和质粒DNA的扩增,细菌菌体的裂解;质粒DNA的提取与纯化。

本实验学习用碱变性方法提取质粒DNA

原理

细菌培养物加入SDS和NaOH碱性溶液处理后,菌体裂解,可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA一起从细胞内释放出来,经琼脂糖凝胶电泳,因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。用溴化乙锭(EB)染色后,在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。根据荧光的位置,可区分不同的核酸带。

材料

1.菌株E.coliJM109(pUC19),E.coliRRI(pBR322)

2.试剂溶液Ⅰ(50mM葡萄糖,25mMTris.HclPH8.0,10mMEDTA

溶液II(0.2NNaOH,1%SDS)用前新配制

溶液III(5mMKAc溶液PH4.8)

TE缓冲液(10mMTris.HCl,1mMEDTAPH8.0)

LB液体培养基(胰蛋白胨10g,酵母粉5g,Nacl10g。加蒸馏水溶解,用NaOH调PH至7.5,加水至1000ml,15磅高压灭菌15分钟)。

方法

1.接种细菌于5mlLB液体培养基中,37℃培养

2.3000rpm/min,离心15min,弃上清。加入100ul溶液Ⅰ悬起细菌沉淀。

3.加入200ul前新配制的溶液II,颠倒EP管5次混合均匀,置冰浴2min。

4.加入150ul溶液III温和地混匀,12000rpm/min,离心5min。

5.吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中,加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提2次,12000rpm/min,离心2min。(若不做酶切,此步可省略)吸取上清放入另一新EP管中,加入二倍体积的冷乙醇,12000rpm/min,离心10min。

6.弃乙醇,干燥后用30ulTE缓冲液洗下核酸,待电泳检测。

二、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳技术(Agarosegelelectroghoresis)是分离、鉴定和提纯DNA断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度,并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应,此外,在弱碱性条件下,DNA分子带负电荷,从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同,它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭(EB)能与双链DNA结合的作用,利用EB染色,并通过紫外线激发即可观察被分离DN段的位置。

材料

1.琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液(40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTAPH8.0)

2.载体缓冲液(0.25%溴酚蓝,30%)、溴化乙锭水溶液(10mg/ml)

3.凝胶槽、电泳仪

方法

1.取琼脂糖0.9g,加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中,100℃加热溶解。

2.平衡凝胶槽,放好两侧挡板,调节好梳子与底板的距离(一般高出底板0.5~1mm)。

3.铺板:在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液,轻轻混匀,待冷至50℃左右倒入凝胶槽,胶厚一般为5~8mm。

 

5.DNA样品与载体缓冲液5:1混合并加入凹孔中(样品不可溢出)。

6.打开电源,调节所需电压,电压与凝胶的长度有关,一般使用电压不超过5v/cm。

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4.待胶彻底凝固后,去掉两侧挡板,将凝胶放入盛有电泳液的槽中(加样孔朝向负,DNA由负极向正极移动),使液面高出凝胶2~3mm,小心拔出梳子。

.据指示染料移动的位置,确定电泳是否终止(溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA带之间)。

8.电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。

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