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DNA实验技术:甲醛变性电泳检测RNA完整性

时间:2013-08-02 浏览次数:1006

一、材料、试剂和仪器

1、材料:植物总RNA 5-10μg

2、试剂:

1)加样运载缓冲液(Loading buffer)

50% 甘油
1mmol/L EDTA (pH 8.0)
0.25%溴酚蓝
25%二甲苯氰FF

2)10×TAE Buffer

3)5×甲醛凝胶电泳缓冲液:

0.1mol/L MOPs (pH7.0)
40mmol/L乙酸钠
5mmol/L DETA(pH8.0)

4)甲醛,甲酰胺

3、仪器:电泳装置,紫外透射观测仪

二、实验程序

1、甲醛变性的琼脂糖(Agarose) 凝胶的配制

在250mL的锥形瓶中准确称量2g Agarose (Sigama),再加20mL 10×TAE Buffer,144mLDEPC处理过的双蒸水,微波炉中化胶,待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛,放置一段时间以减少甲醛蒸汽。

2、RNA的甲醛变性电泳

1) 样品制备
加入无菌离心管中混合,95℃水浴变性2min(或55℃,15min),取出后放入冰中冷却。


RNA总量10μg
5×甲醛凝胶电泳缓冲液4μl
甲醛 3.5μl
甲酰胺10μl

 

2) 加入2μl无菌的DEPC处理的加样运载液。(使用加样运载液的目的有三: 增大样品密度,以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,便于加样操作;能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置。以 0.5 X TBE作电泳液时,溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同,而二甲苯氰FF 的泳动速率与长4kb 的双链线状DNA相同。)

3)将胶板浸没在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中,点样前5V/cm预跑5min。点样后3-4V/cm电泳。

4)电泳结束后(溴苯酚蓝迁移到约8cm处),紫外灯下观察, 照相。

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