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DNA实验技术:SNP实验标准操作规程

时间:2013-08-02 浏览次数:946

一、原理

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性,是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。据估计,在人类基因组中,大约每千个碱基中有一个SNP,无论是比较于限制性片段长度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR),都要广泛得多。SNP是我们考察遗传变异的zui小单位,据估计,人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。一般认为,相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。于是,我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型(haplotype)。大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型(每个具有至少5%的频率),它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。一个染色体区域可以有很多SNP位点,但是我们一旦掌握了这个区域的单体型,就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行基因分型,获取大部分的遗传多态模式。

二、样品准备

1. DNA抽提

①    1、取新鲜肌肉组织约100mg,PBS漂洗干净,置于1.5ml离心管中,加入液氮,迅速磨碎。

②    加200μl 缓冲液GA,震荡至彻底悬浮。加入20μl 蛋白酶K(20mg/ml)溶液,混匀

③    加220μl 缓冲液GB,充分混匀,37℃消化,溶液变清亮。加220μl 无水乙醇,充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。

④    将上述一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB 中,(吸附柱放入废液收集管中)12000rpm 离心30 秒,弃掉废液。

⑤    加入500μl 去蛋白液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm 离心30 秒,弃掉废液。

⑥    加入700μl 漂洗液GW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm离心30 秒,弃掉废液。加入500μl 漂洗液GW, 12000rpm 离心30 秒,弃掉废液。将吸附柱CB 放回废液收集管中,12000rpm 离心2 分钟,尽量除去漂洗液。

⑦    将吸附柱CB 转入一个干净的离心管中,加入100μl 洗脱缓冲液(洗脱缓冲液应在60-70℃水浴预热),混匀,室温放置15 分钟,12000rpm 离心30 秒。洗脱第二次,将洗脱缓冲液50μl 加入吸附柱中,室温放置15 分钟,12000rpm 离心30 秒。

⑧    采用Beckman DU® 640 spectrophotometer 检测提取到的基因组DNA 浓度,在OD260 处有显著吸收峰。同时检测纯度,OD260/280 的值应为为1.7-1.9。

⑨    从原液中取出相应体积DNA 溶液,稀释致50ng/ul,原液置于-70℃保存,稀释液置于-20℃保存。

2. PCR扩增目的片段

按相关的试剂说明在标准反应管中准备反应体系,典型的PCR反应体系如下(20ul体系):

10×Buffer 2ul
Taq酶 1ul 
dNTP 0.5ul
上游引物 0.5ul
下游引物 0.5ul 
无菌水 14.5ul
DNA模板 1ul

向左扳动仪器盖子上的手柄,揭开仪器盖子,小心放置样品管于仪器的相应样品孔中,轻轻盖上盖子,将顶部的旋钮慢慢旋紧,让热盖紧密接触样品管,样品放置完毕。

3. 在T1型PCR仪上编辑一个程序

按[C programs]进入编辑模式。要在主目录中创建一个程序请按[D enter]。要进入一个子目录,用→键将光标向右移动,然后用↑↓键选择一个子目录。按[D enter]进入选择的子目录。

输入程序中要求的温度:用[D enter]确认温度。为其输入时间,用小数点来间隔。顺序为h.m.s。用[D enter]确认时间设置,或者用光标键移动到下一个区域。#表示循环的次数。设定循环值=总循环值-1,即,总循环数为30时应输入“29”。用[C pgm ok]来储存一个完整的程序。程序数据*的储存在记忆中。

4. 运行程序

按[B start/stop]选择一个程序。用→↑↓键选择一个子目录,或者用[D enter]进入主目录。输入您想要启动的程序的号码。或者,按[A list]在该子目录中的所有程序的列表中选择一个程序。用↑↓键在列表中滚动选择。用[D enter]确认用强光突出的程序。按[D start]启动程序。

5. 控制测试过程

运行过程中,按A按钮,可以获得程序剩余的时间信息。运行完成后,按STOP按钮终止实验,按YES确认终止。小心旋开热盖,按照放置样品的操作顺序,打开盖子,取出实验样品,再盖上盖子,关闭电源,本次实验结束。

6. PCR产物测序

由专门负责测序的服务公司完成

7. 数据分析

少量可人工读取,大量可软件读取。比对发现的SNP在基因组中的位置:重点是启动子区、外显子区域(包括编码区的cSNP及5’及3’UTR)、剪切边界等,密码子的改变是否导致氨基酸的改变:错义突变、无义突变、终止突变。

8. 注意事项

①  为保证待测目的区域测序真实可靠,引物设计应该使待测目的区域边界距离上下游引物至少各50bp;

② 引物设计建议使用在线方式,以保证成功率;

③ 为保证测序敏感性,PCR产物片段大小应在250bp-650bp范围;

④ 为方便实验,建议引物合成时分装成1 o.d/管,方便将PCR与测序的引物分开;

⑤ 为保证引物的特异性,建议引物设计后在NCBI上blast确认;

⑥ 为防止降解,PCR产物应尽快测序,否则应该保存在-20℃,且时间不宜过长;

⑦ 为保证结果真实性,建议对关键点进行反向测序确认。

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