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DNA实验技术:区域特异性诱变实验

时间:2013-08-02 浏览次数:854

标签: 区域 特异性 诱变

可在长达3‘的克隆化DN段上产生大量的随机分布的核苷酸替换突变,在将DNA克隆到一个可用来分离单链DNA的载体后,用各种可造成特定碱基损伤的化学试剂处理。

实验方法
  • 基本方案
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1.  用限制性内切核酸酶消化DNA以获得目的DN段,将靶片段双向克隆到M13噬菌体载体或含有M13复制起始子的质粒载体中。从100 ml 感染细抱培养物中提取单链DNA

2.  在三个微量离心管内各加入40 μg 1 mg/ml 的单链DNA,如果靶序列的两条链都要被利用,则需用6个反应。
 
3.  亚硝酸反应:在一个管内加入10 μl pH4.3的2.5 mol/l 乙酸钠和50 μl 2 mol/l 亚硝酸钠,混匀,室温温育60 min。

4.  甲酸反应:在另一管内加60 μl 浓甲酸,混匀,室温温育10 min。

5.  肼反应:在第三个管内加60 μl 浓肼,混匀,室温温育10 min。

6.  毎管加100 μl 2.5 mol/l pH5.5的乙酸钠,30 μg 担体tRNA和1 ml 无水乙醇,置干冰中冻至-80℃,放置10 min,离心10 min,去上清,重复乙醇沉淀两次,再用80 μl TE缓冲液重悬DNA

7.  在重悬的DNA内加10 μl 4种dNTP混合液,10 μl 10×反转录酶缓沖液和100 pmol 的寡核苷酸引物。先在85 ℃温育5 min,再于40℃温育15 min。

8.  加10 μl 4种dNTP混合液和30~40 U 的AMV反转录酶,37℃温育1 h。

9.  用缓冲液平衡酚抽提和乙醇沉淀DNA,DNA重悬于100 μl 10×限制性内切酶缓冲液,并用适当的限制性内切酶切割,以便从载体中回收片段。

10.  酚抽提和乙醇沉淀DNA。DNA重悬于10~15 μl 洗脱缓冲液,并加0.5 μl 2 mg/ml RNAA,37℃温育15 min 以降解担体tRNA
 
11.  在非变性的6%聚丙烯酰胺凝胶电泳上,分离从载体上切下的目的片段,凝胶用溴化乙锭染色,切胶,洗脱出DNA

12.  将纯化的插入DNA连接到具有互补末端的质粒或细菌噬菌体载体中。通过常规的转化程序将连接混合物导入合适的细菌中
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