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DNA实验技术:转染细胞的稳定筛选

时间:2013-08-06 浏览次数:1143

1.确定抗生素作用的*浓度: 不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性,因此在筛选前要做预试验,确定抗生素对所选择细胞的zui低作用浓度。

①  提前 24 小时在 96 孔板或 24 孔板中接种细胞 8 孔,接种量以第二天长成 25%单层为宜,置 CO2 孵箱中 37℃培养。

② 将培养液换成含抗生素的培养基, 抗生素浓度按梯度递增0,(50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μ g/ml)。

③ 培养 10-14 天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为 400-800μg/ml,筛选稳 定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半。

2.转染按前面的步骤进行。

3.转染 72 小时后按 1: 10 的比例将转染细胞在 6 孔板中传代,换为含预试验中 确定的抗生素浓度的选择培养基。在6 孔板内可见单个细胞,继续培养可见单个 细胞分裂繁殖形成单个抗性集落,此时可用两种方法挑选单克隆。

① 滤纸片法:用消毒的 5x5mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上 10-15 秒,取出粘附有细胞的滤纸片放于 24 孔板中继续加压培养。 细胞在 24 孔板中长满后转入 25cm2 培养瓶中,长满后再转入 75cm2 培养瓶中培养。

② 有限稀释法:将细胞消化下来后做连续的 10 倍稀释(10-2-10-10) ,将每 一稀释度的细胞滴加到 96 孔板中培养,7- 10 天后,选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。

4. ELISA或 Westernblot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的 表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量zui高的克隆传代并保种。

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