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DNA实验技术:化学法测定DNA的含量——二苯胺显色法

时间:2013-08-22 浏览次数:1252

(一)原理

DNA 在酸性条件下加热,其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂,生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸,而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖,与二苯胺试剂反应生成蓝色物质,在595nm 波长处有zui大吸收。DNA 在40-400μg 范围内,光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度。

 

(二)试剂及器材

1. DNA标准溶液

准确称取小牛胸腺的DNA 钠盐,以0.01mol/L NaOH 溶液配成200μg/mL 的溶液。

2. 测定样品溶液

准确称取干燥的DNA 制品,以0.01mol/L NaOH 溶液配成100-150μg/mL 的溶液。若要测定RNA 制品中的DNA 含量,样品中至少要含有DNA 20μg/mL 才能进行测定。

3. 二苯胺试剂

称取1g 二苯胺, 溶于100mL 的分析纯的冰乙酸中,再加入60%以上的过氯酸10mL,混匀待用。临用前加入1mL 的1.6%乙醛,配好的试剂应为无色。

4.分光光度计

(三)操作方法

1. 制作DNA 标准曲线:取12 支洁净干燥试管按表1 加入试剂:

表1 DNA标准曲线制作

按上表加完各试剂后,充分混匀。于60℃水浴中保温1h,冷却后于595nm 波长处以1,2 管为空白调零,测定各管光密度(OD595nm)。取两管的平均值,以DNA 的含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线。

2. 样品DNA 含量测定:取2 支干净试管按表2 加入试剂,其它操作同上。

表2 样品DNA 含量测定

待测溶液中的DNA 含量应调整至标准曲线的可读范围内。

3. DNA 含量计算:以样品的光密度,从标准曲线上查出相对应DNA 含量,按下式计算出样品中DNA 的百分含量。

附 注:二苯胺试剂具有腐蚀性,且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色,操作中应防止洒出,比色时,比色杯外面一定要擦干净。

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