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DNA实验技术:聚合酶链反应构建重组DNA

时间:2013-09-04 浏览次数:1349

标签: 聚合酶 重组 DNA

利用聚合酶链式反应(PCR),任何两个DNA片段可连接成一个新的重组DNA分子。通过在PCR引物中引入的额外非同源的核苷酸,可在连接处产生所需要的读码框架或酶切位点。用该技术并不需要知道待亚克隆的DNA的核苷酸序列,只需要知道两小段伸展于片段两俩的区段作为扩增反应的引物结合区。

实验方法
  • 基本方案
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1.  制备模板DNA,如DNA不是经氯化铯梯度纯化的,100℃煮沸10 min 以灭活核酸酶。
 
2.  制备寡核苷酸引物,若PCR产物要进行平端克隆,就应该对引物的5’端羟基进行磷酸化处理。
 

图一、用PCR反应引入单一的酶切微点和产生符合读码框架的融合蛋白。
 
3.  建立标准的扩增反应,以矿物油覆盖表面,在以下条件下进行20~25轮扩增循环:94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸3 min,zui后一个循环在72℃延伸10 min 尽可能使扩增产物完整。
 

图二、序贯PCR法构建重组DNA分子,引物1b与基因2同源区域;引物1c有与基因1同源区域
 
4.  取少量反应混合物(4~8 μl),用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增效果。
 
5.  吸去矿物油上层,用氯仿抽提1次除去残存的矿物油,用饱和酚抽提1次,然后用无水乙醇沉淀DNA。
 

图三、用反向PCR插入酶切位点
 
6.  4℃高速离心10 min,沉淀用20 μl TE缓冲液溶解。

7.  用玻璃珠,电冼脱或低融点胶的酚抽法进一步纯化PCR产物可去除未掺入dNTP引物、无关的PCR产物和模板DNA。
 
8.  对于通过平端连接进行的克隆:用DNA聚合酶I (或klenow酶)修平扩增片段的3‘末端。
 
9.  对于通过粘端连接进行的克隆:在20 μl 体积用合适的酶消化一半PCR只产物,用过量的酶消化数小时。
 
10.  用合适的末端互补的酶在20 μl 体积内消化0.2~2 μg 载体DNA,用CIP去瞵酸化,以阻止载体自连。

11.  用普通琼脂糖或低融点琼脂溏电泳分离线性化的载体。

12.  用玻璃珠、电洗脱、或酚抽法回收线状的载体。

13.  连接PCR片段和线状载体。
 
14.  取部分连接产物转化大杨杆菌,从转化体集中以小量制备法提取质粒DNA。

15.  用合适的酶消化转化体的质粒DNA,以琼脂糖凝胶电泳分析以确证片段的插人。

16.  测定质粒DNA中扩增片段的序列,检查有无突变,或者用生物化学或遗传学方面的功能分祈筛选转化体。
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