产品分类

您的位置:首页 > 公司新闻 > DNA实验技术:T4 DNA聚合酶实验

公司新闻

DNA实验技术:T4 DNA聚合酶实验

时间:2013-09-04 浏览次数:1584

标签: T4 DNA 聚合酶

T4 DNA 聚合酶具依赖人为模板的聚合酶活性,同时具有对单链、双链DNA的3’到5’端的外切酶活性,缺少5’到3’端的外切酶活性。

实验方法

  • T4 DNA聚合酶

实验材料

DNA

试剂、试剂盒

Trish·Cl dNTP MgCl2 BSA DTT

仪器、耗材

水浴锅

实验步骤

一、50 μl 反应体积:


(1)50 mmol/l  Tris·Cl,pH8.0

(2)5 mmol/l  MgCl2

(3)5mmol/l  DTT

(4)100 μmol/l  4dNTP混合液

(5)50 μg/ml  BSA

(6)0.1 U  T4DNA聚合酶

(7)2 μg  DNA

(8)11℃温育20 min,加入2 μl 0.5 mol/l EDTA或75℃加热10 min以终止反应。

(9)反应体枳、4种dNTp的浓度、反应温度可依具体应用而变。

 

二、dNTp浓度的效应

 

1.  高浓度的dNTP在通常实验下可以增加聚合酶活性对外切酶活性的比值。

2.  在标记实验中,标记了dNTP的浓度降至1到2 μmol/l,但标记dNTP不能低于1 μmol/l 浓度,否则当dNTP耗竭时,会导致其外切酶活性对的降解。

 

三、度的效应

 

用T4 DNA聚合酶标记3’末端时,反应温度保持在11℃,在较髙温度下,其外切酶活性易降解DNA模板。

收起 
其他

一、缓冲系统的相容性

 

许多限制性内切酶能在T4 DNA聚合酶的缓冲系统进行切割反应,同时,T4 DNA 聚合酶也能直接使用。


二、应用

 

1.  放射性标记DNA段的3’末端,含5’凸出端的DNA段及浓度为1~2 μmol/l 的适当[α-32P]dNTP,在11℃温育20 min。

 

2.  选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3’宋端,即所谓的“置换合成”。双链 DNA段在dNTP存在下与T4 聚合酶温育,其3’末瑞的外切酶活性导致从 3’末端降解DNA,当补加4种dNTP后,可激活其聚合酶活性,延伸DNA镆板的3’末端。在T4 DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板时加入4种dNTP混合液,可获得zui隹标记效果。

3.  变双链DNA的粘性末端成平端,便于平端克隆。在髙浓度4dNTP种存在下,酶促的 降解终止于双链区,类似地,如果末端存在5‘凸出,酶将延伸凹进陷的3’端直至与5’端平齐。在实际应用中,DNA与T4 DNA聚合酶和浓度各100 μmol/l dNTP在温育20 min。 

在线客服
返回顶部