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DNA测序:测序常见问题及其分析

时间:2013-10-12 浏览次数:1950

1、PCR 产物测序时出现重叠峰
问题图1(模板中有碱基缺失,往往是单一位点(1-1)或两个位点(1-2)碱基缺失导致测序结果移码)
图1-1


图1-2

 
解决方法:将PCR 产物克隆到质粒(如T 载体)中挑单克隆测序,或将PCR 产物进行PAGE纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序。问题图2(PCR 产物不纯,含部分序列一致的两种以上的片段,长度不一)

图2

 
解决方法:主要原因是PCR 产物没有纯化,含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段,将PCR 产物进行PAGE 纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序,便可解决。
 
问题图3(测序引物有碱基缺失)

 
测序引物有碱基缺失(一般是引物的5'端缺失),和模板的碱基缺失即图1 有些类似,所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码,而引物碱基缺失的话,则从测序一开始就出现移码,表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。
解决方法:重新合成引物,或将引物进行PAGE 纯化(注:好多公司虽然称提供的引物为PAGE级,但是,嘿嘿……)

2、克隆测序时出现峰形重叠


原因:所挑选的重组子不是单克隆,所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒;或是是送测序的菌液污染。
 
解决方法:重新挑单克隆的菌落(划线分离单菌落),提质粒或送菌液再次测序。

3、样品有杂合/突变位点


模板中有杂合型突变,也就说模板本身在这个位点出现突变;或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。如果模板有杂合(突变或缺失),那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形,然后突然在某一個位點出現重叠峰(如图中箭頭所示)。
 
解决方法:建议将DNA 片段克隆到载体再测序。
 
4、polyA/T 和C/G cluster 导致的套峰和测序信号衰减
 
图4-1

图4-2
略(太大无法上传,删除部分图片)

图4-3

图4-4

RACE 测序时经常遇到图4-1 和图4-4 的情形,解决方法:从另一端测序;但如果这样的序列出现在中间,呵呵,目前还没有很好的解决方法,要看测序公司的本事了。C/G cluster 在PrV 基因组测序时遇到过。后来还是让TaKaRa 公司给解决了,虽然不喜欢鬼子,但有时候却不得不用它们的产品和服务。
 
5、基因中含有重复序列


可能的原因: 样品中含有重復序列导致的测序结果和PolyA/T 的结果一样,会导致Frame 滑动,较短的重復序列会导致测序结果出现移码;而较长的重復序列会使定序信号衰减。

解决办法: 反向测序有时能够顺利的通过重復序列区域(但不是一定都能够),通过多次的测序结果比对,拼接可以得到全序列结果。
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