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醋酸纤维薄膜电泳分离血清的蛋白质

时间:2015-05-15 浏览次数:2383

实验原理


        带电荷的蛋白质,在电场中向着与其所带电荷电性相反的电极泳动称为电泳。血清中各种蛋白质的等电点不同,但大都在pH7以下,若将血清置于pH8.6的缓冲液中,则这些蛋白质均带负电,在电场中都向阳极移动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带负电荷多少及分子大小不同,所以在电场中向阳极泳动速度也不同。蛋白质分子小而带电荷多者,泳动速度快;反之,则泳动速度慢。因此可将血清蛋白质依次分为清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五条区带,经染色可计算出各血清蛋白质含量的百分数。

        以醋酸纤维薄膜(CAM)为支持介质,电泳分离后经染色处理,可展示出清晰的蛋白质电泳图谱。由于染色时染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正比,因此将各蛋白质带剪下,分别用一定量的NaOH稀溶液洗脱下来,即可进行比色,测定出各蛋白质区带的相对含量。也可用一定量的有机溶剂使CAM溶解制成透明膜而用光密度计进行扫描定量。

        醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便及分辨率较高等优点,广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。



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实验试剂


1.巴比妥—巴比妥钠缓冲液(pH8.6,m=0.06)。称取巴比妥2.21克和巴比妥钠12.36克,溶于500毫升蒸馏水中,加热溶解。待冷至室温后,再加蒸馏水稀释至1000毫升。

2.染色液

(1)丽春红S染色液:称取丽春红S O.4g、三氯醋酸6g,用蒸溜水溶解并稀释至100ml。

(2)氨基黑10B染色液:称取氨基黑(C22H13O12N6S3Na3)10B 0.1g,溶于20ml无水乙醇中,加冰醋酸5ml,使其溶解。另取磺基水杨酸2.5g,溶于少量的蒸馏水中,加入前液将两液混合摇匀,再以蒸馏水补足至100ml。称取丽春红S0.4克及三氯醋酸6克;用蒸馏水溶解,并稀释至100毫升。

3.漂洗液。

   (1)3%(V/V)醋酸溶液:适用于丽春红S染色的漂洗。

   (2)甲醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml混匀,适用于氨基黑10B染色的漂洗。

4.透明液  取无水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混匀备用。

5. 洗脱液

   (1)0.1mol/L NaOH溶液:用于丽春红S染色的洗脱。

   (2)0.4mol/L NaOH溶液:用于氨基黑10B染色的洗脱。

6.40%(V/V)醋酸溶液。


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实验设备

        电泳仪、电泳槽、分光光度计或光密度仪。

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实验材料

        醋酸纤维薄膜、培养皿、滤纸、镊子、点样器、直尺、铅笔、剪刀等。

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实验步骤


1、电泳槽的准备    
      将巴比妥-巴比妥钠缓冲液加入电泳槽中(两侧槽内注入等量的缓冲液),调节两侧内的缓冲液,使其在同一水平面,液面与支架的距离约为2~2.5cm。支架宽度到恰好适合CAM的长度,用3~4层滤纸或4层纱布搭桥。

2、CAM准备   
      取醋纤薄膜(2厘米*8厘米)在CAM的无光泽面(涂有醋酸纤维素)距一端1.5cm处用直尺和铅笔轻划一线(与CAM的长轴垂直),作点样标记,将膜条编号后将无光泽面朝下浸入巴比妥-巴比妥钠缓冲液中,待充分浸透后取出(一般约需求20~30min),夹于洁净的滤纸中,吸去多余的缓冲液.

3、点样    
      用血清加样器将3-5ul无溶血的新鲜血清均匀地点在划线处,样品应与膜的边缘保持一定距离,以免电泳图谱中的蛋白区带变形。待血清渗入膜后移开点样器。点样应注意,要适量、均匀和垂直,并避免弄破薄膜。

4、平衡   
      将已点样的薄膜加样面朝下,点样端置于阴,将膜条紧贴于电泳槽支架的盐桥上并保持平直,桥的另一端垂入缓冲液中,盐桥将膜的两端与缓冲液连通,加上槽盖平衡5min后通电电泳。

5、电泳    
      正确联接电泳槽与整流器对应的正负极,点样侧接负极,另一侧接正极。开启电源通电。调节电压10V~15V/cm膜长,电流0.4~0.6mA/cm膜总宽,电泳40-60分钟(通常夏季需45min,冬季需60min),待电泳区带展开3.5cm~4cm时即可关闭电源。

6、染色    
      通电完毕,立即取出薄膜直接浸入丽春红S或氨基黑10B染色液中,染色5~10分钟。

7、漂洗    
      至少准备3~4个漂洗皿,装入漂洗液。从染色液中取出薄膜条并尽量沥去染色液,按顺序投入漂洗液中反复漂洗,直至背景漂白为止。此时清晰可见5条色带。待干。

8、定量    

   (1)洗脱比色法  取六支试管,分别标明“A、α1、α2、β、γ、空白"。将漂洗净的薄膜剪下各区带放入相应的试管内,另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中,根据染色不同按以下方法洗脱。

     ①氨基黑10B染色洗脱:6支试管于清蛋白管内加入0.4mmol/L NaOH溶液6ml,其余5管各加3ml,振摇数次,置37℃水浴20分钟,使色泽完全浸出。用620nm波长,以空白管调零,读取各管的吸光度,其中清蛋白管吸光度×2。

     ②丽春红S染色洗脱:洗脱液用0.1mmol/L氢氧化钠溶液,加入量同上。10分钟后,于清蛋白管内加入40%(V/V)醋酸0.6ml,其余5管各加入0.3ml,以中和部分氢氧化钠,使溶液色泽加深。如出现沉淀,可离心取上清液比色。用520nm波长,以空白管调零,读取各管的吸光度,其中清蛋白管吸光度×2。

  (2)光密度扫描法

     ① 透明:将已漂净吹干的CAM条浸入透明液中3~5分钟,取出平铺于洁净干燥玻片上(应无气泡),直立片刻除去过多的透明液。于90~100℃烘箱内烘烤5~10分钟,取出冷却至室温。此法透明的CAM,各蛋白区带鲜明,薄膜平整,可直接扫描或作*保存。若用十萘氢或液体石醋透明,应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明,透吸后的薄膜不能久藏,易发生皱折。

     ② 扫描定量:将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其它光密度扫描的光路,选择波长520nm,描记各蛋白区带峰,并计算各蛋白成分的相对含量。

9、计算

      定量计算时,先计算各光密度值的总和:再计算血清各部分蛋白质所占的百分率

                                                                                  吸光度总和(T)=2A+α1+α2+β+γ(吸光度)

                                      

                                                                                        血清各蛋白组分的相对百分数=Ax/AT×100%

                                 

                                                                              Ax表示各球蛋白组分 (2A+α1+α2+β+γ)的吸光度。 

                          

                                                                                             A%=2A/ T×100%       β=β/ T×100%       

                                       

                                                                  α1%=α1/ T×100%        γ%=γ/ T×100%       α2%=α2/ T×100%

                      

                                                           各组分蛋白质含量(g/L)=(各组分蛋白百分数(%)×血清总蛋白g/L)/100


10、临床意义

  (1)血清蛋白醋纤薄膜电泳的正常参考值为:

         蛋白质组分                g/L             占总蛋白百分比(%)   

  白蛋白                  35~52               57.0~68.0

        α1球蛋白              1.0~4.0             1.0~5.7

       α2球蛋白              4.0~8.0              4.9~11.2

        β球蛋白               5.0~10.0             7.0~13.0

        γ球蛋白               6.0~13.0             9.8~18.2

  (2)临床意义

        电泳图谱可为临床疾病诊断提供依据。

        肾病型可见于急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭等,图型表现为Alb降低,α2和β升高;肝硬化型可见于慢性活动性肝炎、肝硬变等,图型表现为Alb降低,β和γ增高,可出现β与γ难以分离而连接在一起的“β-γ"桥,此现象是由于肝脏纤维增生导致IgA增高所致;急性反应时相型常以α1、α2增高为特征;慢性炎症型则以Alb降低,α2、γ增高较为常见;M蛋白血症主要见于多发性骨髓瘤,病人有大量单克隆蛋白质(主要是IgG或IgA),电泳时可在β和βγ之间出现一条峰形狭窄的区带,称M区带。





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注意事项


1.通电时,不得接触槽内的缓冲液或CAM,以防触电。

2.每次电泳时应交换电极以使两侧电泳槽内缓冲液的正负离子相互交换,以使缓冲液的PH维持在一定水平。

3.电泳缓冲液的液面要保持一定的高度,过低可能会出现γ球蛋白的电渗现象(γ球蛋白向阴极移动),同时电泳槽两侧的液面应保持在同一水平,否则,通过薄膜时有虹吸现象,将会影响蛋白质分子的泳动速度。

4.电泳失败或图谱不理想的常见原因

    (1)电泳图谱不整齐或蛋白各组分分不佳:点样过多;点样不均匀、不整齐;薄膜过湿,样品扩散;点样速度太慢,薄膜表面局部干燥或薄膜未完全浸透或温度过高致使膜面局部干燥或水分蒸发;缓冲液变质;电泳时薄膜放置不正,歪斜、弯曲,与电流方向不平行;样品不新鲜;电流过低;CAM质量不好,薄膜结构过分细密,透水性差,导电差等。

    (2)染色后白蛋白中间着色浅:染色时间不够或染色液陈旧;白蛋白含量过高,可减少血清用量或延长染色时间。

    (3)电泳速度慢:电流过低;供给薄膜的缓冲液不足,连接薄膜与缓冲液的滤纸或纱布过薄;温度过低;薄膜结构过分细密,透水性差,导电差;缓冲液水分蒸发,致使离子强度增大。

    (4)薄膜透明不完全:透明液陈旧;浸泡时间不足;烘箱温度未到90℃即把薄膜放入。

5.染料问题:各种染料对血清各组分有不同的亲和力,大多数染料对白蛋白的亲和力大于球蛋白。如氨基黑10B对球蛋白的结合力为白蛋白的80%,因此常导致白蛋白结果偏高,球蛋白偏低。用丽春红S染色,效果优于氨基黑10B。丽红是一种指示剂,PH<10时呈红色,PH>12.5时呈紫色。在酸性溶液中它的zui大吸收峰在523nm左右,呈对称性。在血清蛋白正常浓度范围内,丽春红S能与各蛋白质组分成正比例结合,而氨基黑10B则对白蛋白染色过深,区带中容易出现着色不全的小点,不够理想。

6.样品要求点在粗糙面(无光泽面),否则样品很难吸入膜内。电泳时将点有样品的一面朝下,以防电泳过程中水分蒸发,影响电泳结果。

7.标本应新鲜,不得溶血。溶血标本会使β球蛋白假性升高,因血红蛋白电泳位置在β球蛋白区域内。

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